Конечные стадии при биотехнологических процессах

Отделение, очистка и модификация продуктов

Выделение продуктов биосинтеза

Общая схема этой стадии технологического процесса представлена на рис. 12. Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуральной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр – прессы, вакуум – барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культирования, типа клеток, свойства культуральной жидкости.

Рис. 12. Выделение продуктов биосинтеза

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуга, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобства этого способа – необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов окружающих среду, невозможность полного удаления клеток и среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды – фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляются за счет накопления клеток на поверхность фильтра. Увеличение давления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки забивают поры, образуя менее проницаемый слой.

Завершающие стадии биотехнологических процессов – выделение целевого продукта – существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.

Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах.

Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.

Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка. (изменения структуры конечного продукта).

Клеточные стенки микроорганизмов состаят из разных полимеров, по этому универсального метода их разрущения не существуют.

У грамположительных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N –ацетилглюкозамина и остатков N – ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками.

У грамотрицательных бактерии клеточная стенка тоньше и покрыты снаружи слоем липидов.

Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и β – глюканов.

Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из α и β глюканов, гликопротеидов и хитина.

Состав и прочность клеточной стенки зависит от условий культивирования, скорости рост клеток, фазы, на которой они собираются, условия хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген.

Химический метод разрушения клеточных стенок – обработка щелочью. Если белковый продукт не разрушаются при рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гармон роста человека очень просто выделить из клеток Е. coli обработкой натрия гидрокарбонатом при рН 11. После обработки щелочью не остается практически не одной жизнеспособной клетки, что автоматически решают проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов.

Основной биохимический метод разрушения клеток микроорганизмов – лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, β-1,2- и β-1,6- глюканазой, хитиназой – или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происходит в мягких условиях.

Клетки можно разрушать физическими методами: немеханическими (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживанием-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомогенизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффективно, особенно УЗ-излучателями, генерирующимим высокочастотные звуковые волны. УЗ-дезинтеграторы состоят из транзисторного генератора УЗ-волн, пьезоэлектрического или магнитострикционного преобразователя, набора рабочих камер (аппарат на основе УЗ-диспергатора УЗДН-1, Россия).

При большом количестве клеток используют баллистическую дызентиригацию, ее проводят в высокоскоростных шаровых мельницах, куда помещают концентрированную суспензию клеток. Камера мельницы заполнена инертным абразивным материалом (стеклянными, полимерными шариками диаметром 1 мм). Содержимое быстро перемешивают лопасти, насаженные на ось. Большинство клеток разрушаются под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков относительно друг друга, поверхности лопастей и камеры. Условия оптимального разрушения клеток подбирают, варьируя числом и формой лопастей, скоростью перемешивания, числом и размером шариков, геометрией камеры, температурой, концентрацией клеток (аппараты фирмы «Willi A. Bachhotem», Швейцария, «Gifford Wood Co», США).

Соударения – клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность, в месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Активность клеточных белков при разрушении клеток методом соударения уменьшается незначительно.

Экструзионные методы (продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия) предназначены для обработки жидких или замороженных суспензий клеток. Диаметр отверстий рабочих матриц составляет от нескольких миллиметров до десятых его долей. В гидроэкструдерах давление достигает 2000-4000 кг/см², в твердофазовых экструдерах – 10000-50000 кг/см². После экструзии давление резко сбрасывают, что вызывает лизис клеток. Экструзионные дезинтеграторы производят фирмы «Manton Gaulin» (США), LKB (Швеция).

Дальнейшая обработка. После разрушения клеток их осколки удаляют низкоскоростным центрифугированием или микрофильтрацией через мембрану.

Завершающей стадией любого микробиологического производства является выделение целевого продукта из культуральной среды и его очистка. Таким целевым продуктом может быть либо биомасса клеток, либо какой-то продукт клеточного метаболизма. Если целевой продукт находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур или оболочки), то он является эндометаболитом, если выделяется клеткой в культуральную жидкость - экзометаболитом.

В большинстве случаев извлечения эндометаболитов необходимо предварительное разрушение клеток. Однако этот процесс удобнее проводить не непосредственно в культуральной среде, извлекаемой из реактора, а с концентратом клеток после удаления культуральной жидкости. Поэтому первым этапом выделения большинства продуктов микробиологического синтеза является отделение биомассы микроорганизмов продуцентов из культуральной жидкости. При этом в зависимости от типа используемых микроорганизмов могут применяться самые различные методы.

Для отделения бактериальных культур применяются вакуум-фильтры: нутч-фильтры, ленточные, барабанные, камерные. Фильтрование бактериальных суспензий сопряжено с большими трудностями, которые обусловлены малым размером клеток, высокой вязкостью суспензий и наличием большого количества примесей микрочастиц. Поэтому стадии фильтрования обычно предшествует предварительная обработка суспензий с целью максимально возможной коагуляции клеток и примесей в более крупные и легко фильтруемые частицы. Применяются несколько видов коагуляции: тепловая, органическими и неорганическими кислотами, неорганическими солевыми электролитами (Na₂SiO₃, Na₂HPO₄), которые взаимодействуют с ионами Са²⁺, находящимися в культуральной жидкости, с образованием труднорастворимых соединений.

Ca²⁺ + Na₂SiO₃ ® CaSiO_3¯ + 2Na⁺

Ca²⁺ + Na₂HPO₄ ® CaHPO_4¯ + 2Na⁺

Образующиеся частицы осадка захватывают клетки микроорганизмов и примеси.

Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов, таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляция. Эффективным методом коагуляции суспензий является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флоккулы, или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Образующиеся в результате коагуляции и флокуляции крупные частицы перед фильтрованием могут быть подвергнуты седиментации (осаждению под действием силы тяжести) с последующей декантацией надосадочной жидкости, которая далее может быть дополнительно очищена фильтрованием.

Осадки большинства микробных клеток относятся к разряду сжимаемых, то есть уплотняющихся, поэтому со временем скорость фильтрации будет, заметно уменьшаться. Для облегчения фильтрации микробных суспензий и уменьшения перепадов в скоростях фильтрации используют барабанный фильтр с намывным слоем - аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность барабана намывают дренажный слой наполнителя, представляющего собой порошок диатомита, фильтрперлита (размолотые вулканические породы, содержащие SiO₂ и Al₂O₃) или древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие от обычного вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя, таким образом, фильтрующую поверхность; поэтому скорость фильтрации не снижается.

Для предварительного концентрирования (сгущения) более крупных и тяжелых клеток дрожжей и микрогрибов широко используют флотацию. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы клетки. Процесс проводят в специальных аппаратах - флотаторах, в которых нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят и выводят сконцентрированную в 4-6 раз суспензию клеток (получение пекарских дрожжей).

Для последующего концентрирования и отделения биомассы грибов и дрожжей используют сепарирование (одноступенчатое или многоступенчатое)

для разделения суспензий и эмульсий, а так же центрифугирование для отделения твердых осадков и клеток от культуральной жидкости. Так для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600 г/л с помощью сепаратора- сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3, необходимо последовательное сепарирование в 2-3 ступени. С помощью центрифуг различных конструкций удается отделять из культуральных жидкостей бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Наличие в культуральной жидкости высоковязких компонентов, таких как различные экзополисахариды типа декстрана, аубазидана, пуллулана и др. существенно затрудняет процесс центрифугирования.

Для извлечения целевых продуктов эндометаболитов из концентрата микробной биомассы ее либо обрабатывают каким-либо экстрагентом без разрушения клеток (экстракция петролейным эфиром биожира из кормовой биомассы дрожжей, извлечение полиеновых антибиотиков), либо клетки разрушают каким-либо из методов, а затем экстрагируют продукты.

Для разрушения (дезинтеграции) клеток применяют целый набор методов, которые можно отнести к трем основным группам: физико-механические, химические и энзиматические (ферментные) методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в то же время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию или разрушение целевого продукта. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из различных полимеров (иногда сопоставимых или превосходящих по прочности лучшие сорта сталей), то никакого универсального метода их разрушения не существует.

К физическим методам относятся: разрушение клеток баллисти­ческим способом с применением бус баллотини, кварцевого песка, растирание клеток в дисковой мельнице, дробление замороженных в жидком азоте или в сухом льде клеток; экструдирование клеток под высоким давлением (2-5 атм) через узкую щель или отверстие; газодекомпрессион­ная дезинтеграция, основанная на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок; ультразвуковая дезинтеграция.
Энзиматические методы основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную стенку: лизоцима, выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего главным образом оболочки бакте­ри­альных клеток; ферментного комплекса, содержащегося в желудочном соке улитки Helix pomatia или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов, лизирующего оболочки эукариотических клеток, в частности грибов.

Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.

Выбор метода дезинтеграции определяется целью работы: для получения внутриклеточных ферментов наиболее приемлемы баллистические и экструзионные способы; энзиматические методы широко применяют в научных исследованиях для выделения в целости различных субклеточных структур (органелл, мембран и т.д.), а так же для получения протопластов. Применение химических методов дезинтеграции микроорганизмов ведет к нарушению целостности клеточных структур, инактивации ферментов. Поэтому химические методы обычно применяют для получения пищевого белка и биожира из дрожжей.

В результате обработки клеточной биомассы по одному из методов дезинтеграции получают гомогенат, содержащий неразрушенные клетки, оболочки разрушенных клеток, обрывки мембран, различные клеточные структуры, которые могут быть отделены путем фильтрования. При этом большая часть веществ-эндометаболитов переходит в культуральную жидкость или раствор экстрагента.

Дальнейшее выделение и очистка целевых продуктов из культуральной жидкости или экстрактов зависит от их химической и физической природы.

Для извлечения таких соединений, как спирты, карбонильные соединения, кислоты, их производные, большинство антибиотиков, витаминов, алкалоидов, применяют обычные приемы и методы, используемые в химической технологии (перегонку, выпаривание, экстракцию, перекристаллизацию, возгонку и др.). В качестве примера приведем технологию экстракционного выделения бензил­пенициллина из культуральной жидкости.

Современное производство бензил­пенициллина включает в себя стадию глубинного культивирования микроорганизма-продуцента с последующим извлечением целевого продукта из культуральной жидкости.

На первом этапе мицелий отфильтровывается от культуральной жидкости (обычно на барабанных вакуум-фильтрах непрерывного действия). Фильтрат культуральной жидкости (нативный раствор) затем подвергается предварительной обработке (дополнительная фильтрация с применением активированного угля).

Выделение ­пенициллина из нативного раствора основано на способности пенициллина в виде кислоты растворяться в бутилацетате, в воде он нерастворим. Калиевая соль ­пенициллина, напротив, хорошо растворима в воде и нерастворима в бутилацетате. В производстве после передачи нативного раствора цеху химической очистки в сборник нативного раствора перед началом экстракции добавляют 0.03-0.06 масс.% дезэмульгатора (авироль) для лучшего разделения эмульсии.

Нативный раствор из сборника подают в эмульгатор, куда одновременно подается 9-12% раствор H₂SO₄ и охлажденный бутилацетат. В эмульгаторе происходит смешивание всех трех компонентов и экстрагирование бензил­пенициллина (кислоты) бутилацетатом. Температуру процесса поддерживают в пределах 10-12⁰С, рН среды – 2,8 ± 3,0. При таком значении рН резко уменьшается степень диссоциации карбоксильных групп молекул бензилпенициллина, в недиссоциированном состоянии они переходят в органическую фазу (бутилацетат).Более сильные кислоты и другие электролиты находятся в диссоциированном состоянии и поэтому не растворяются в бутилацетате; в водной фазе остаются почти все минеральные компоненты, аминокислоты, водорастворимые белки. Затем эмульсия поступает в экстрактор, где дополнительно обрабатывается бутилацетатом.

Далее бутилацетатный экстракт последовательно отмывают обессоленной водой и подвергают двухступенчатой экстракции водным раствором бикарбоната натрия при рН = 7,3 -7,8. При этих условиях пенициллин находится в диссоциированном состоянии и хорошо растворяется в водной фазе и практически не растворим в бутилацетате. На данной стадии удается, очистится от примесей (в основном органических), являющихся более слабыми кислотами, чем бензилпенициллин.

Из бикарбонатного экстракта антибиотик вторично экстрагируют бутилацетатом при рН = 2,2 – 2,5.

Полученный вторичный бутилацетатный экстракт осветляют обработкой с активированным углем, далее вымораживают при -5°С в течение 20-30 минут, отфильтровывают от кусочков льда и кристалликов сульфата натрия, обезвоживая, таким образом, бутилаце­татный экстракт.

Выделение калиевой соли бензил­пенициллина из бутилацетатного экстракта проводят путем добавления рассчитанного количества насыщенного раствора ацетата калия (раствор ацетата калия готовят в отдельном аппарате).

Полученную калиевую соль дополнительно очищают перекристаллизацией из водно-бутанольного раствора, полученные кристаллы отфильтровывают, промывают безводным бутанолом и сушат.

Наибольшую сложность представляет выделение продуктов белковой природы: ферментных препаратов, белковых антител, вакцин, гормонов и других физиологически активных веществ. Поэтому рассмотрим подробнее особенности их выделения и очистки на примере получения ферментных препаратов.

ІV. Иллюстративный материал: прилагается

V. Литература:

основная:

1. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Изд. центр «Академия», - 2008. – 208 с.

2. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций. – Минск.: БГУ, 2002. - 105 с.

3. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология: Учебное пособие. – М.: Изд. Центр «Академия». – 2006. – 256 с.

4. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология. Руководство к практическим занятиям. – Учебное пособие. – Под ред. акад. РАМН В.А. Быкова, проф. А.В Катлинского. – М.: ГЭОТАР-Медиа 2009. – 384 с.

5. Елинов Н.П. Химическая микробиология. - Учебник. - М.: Высшая школа. - 1989, 448 с

6. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. - Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ. - 1989, 294 с.

7. Биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. - М.: Мир. - 1988, 480 с.

8. Чуешов В.И., Зайцев А.И., Шебанова С.Г. Промышленная технология лекарств. Том 2. Харьков, 2002.

9. Биотехнология микробного синтеза (Под ред. Бекера М.Е.) – Рига – 1980.

10. Биотехнология. (Отв. редактор А.А. Баев). - М.: Наука. - 1984, 310 с.

11. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов. М., - 1979 г.

12. Промышленная микробиология (Под ред. Егорова Н.С.) – М., 1989 г.

13. Процессы и аппараты химической технологии (Под ред. П.Г. Романкова). – Л. – 1981.

дополнительная:

1. Березов Т.Т., Коровкина Б.Ф. – Биологическая химия (Под ред. И.М. Ивановой) – М., Медицина – 1981 г.

2. Никитин Г.А. – Биохимические основы микробиологических производств – Киев, 1981.

3. Бриттон Г. – Биохимия природных пигментов. М., Мир – 1986 г.

4. Попова Т.В. – Развитие биотехнологии в СССР – М., Наука - 1988 г.

5. Популяционные аспекты биотехнологии – Печуркин Н.С., Брильков А.В., Маркенкова Т.В. – Новосибирск: - Наука – 1990 г.

6. Специальные журналы: «Биотехнология», «Фармация Казахстана», «Фармацевтический бюллетень» и др.

VІ. Контрольные вопросы (обратная связь):

1. Назовите методы отделения биомассы от культуральной жидкости.

2. Что такое дезинтеграция и применяемые методы?

3. В чем разница между эндометаболитом и экзометаболитом?

Дата добавления: 2014-01-04