Методы слияния протопластов клеток

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов ― своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки микроорганизмов. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

· скрещивание генетически отдаленных видов микроорганизмов;

· получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одной из материнских клеток наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другой;

· слияние трех и более клеток;

· получение гибридов, представляющих сумму генотипов материнских клеток;

· перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов;

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость деления, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов молодых клеток или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

Для слияния протопластов используют два основных подхода:

1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са²⁺(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами (например, мезофильные протопласты).

2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы ― продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы ― продукты слияния генетически неидентичных клеток.

Далее возможны следующие варианты поведения слившихся протопластов:

· синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток;

· слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток.

Дата добавления: 2014-01-04