Методы культивирования и титрования бактериофагов (по Грациа и Аппельману)

Классификация фагов по характеру взаимодействия с бактериальной клеткой (умеренные и вирулентные). Лизогения и лизогенная конверсия.

Бактериофаги, их природа, строение, формы существования (вегетативный фаг, зрелый фаг, профаг).

Бактериофагия (от греч. phagos – пожирающий) – действие бактериофага («пожиратель» бактерий), заканчивающееся лизисом бактерий. Бактериофаг (фаг) – вирус бактерий. Номенклатура фагов основана на виде хозяина. Фаг, лизирующий дизентерийные бактерии, – дизентерийный бактериофаг, сальмонеллы – сальмонеллёзный фаг, дифтерийные бактерии – дифтерийный фаг.

Морфология и химический состав бактериофагов.

Наиболее изучены фаги кишечных палочек – T-чётные фаги (T – типовые). Фаг Escherichia coli.

Большинство имеют форму сперматозоида. Могут быть кубические или нитевидные. Размеры от 20 до 80 нм, у нитевидных фагов – до 800 нм. Состоят из икосаэдральной головки и хвоста.

Головка содержит нуклеиновую кислоту (ДНК, редко РНК), несущую генетическую информацию, снаружи покрыта белковым капсидом. Если головка имеет кубический тип симметрии, то хвост – спиральный тип. Хвостовой отросток внутри полый, имеет стержень, покрыт чехлом, заканчивается 6-угольной базальной пластиной, от которой отходят 6 шипов и 6 нитей (фибрилл). Нити выполняют адсорбционную функцию. Капсид и чехол отростка состоят из полипептидных субъединиц.

Функции чехла: защита и участие в передаче вирусной ДНК бактерии.

Функции головки: хранение и передача патогенных свойств.

Резистентность фагов.

По сравнению с вирусами более устойчивы. Эфир, этиловый спирт не инактивируют их. Чувствительны к формалину и кислотам. Длительно сохраняются при низких температурах и высушивании. Инактивируются при температуре выше 65˚ C.

Морфологические типы бактериофагов.

1. Нитевидные

2. Фаги с аналогом отростка

3. Фаги без отростка

4. Фаги с коротким отростком

5. Фаги с несократимым чехлом отростка

6. Фаги с сокращаемым чехлом отростка

Фаги:

1. ДНК-содержащие

2. РНК-содержащие

Большинство фагов содержат двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо, но могут быть однонитевые. Внутри фага есть белки: геномные белки и ферменты – лизоцим и АТФ-аза.

Умеренные фаги имеют 3 формы:

1. зрелый (внеклеточный)

2. вегетативный

3. профаг

Умеренные бактериофаги, попав в бактериальные клетки, лизируют не все клетки популяции. С частью клеток они вступают в симбиоз. ДНК фага встраивается в хромосому бактерий. Это состояние называется профаг (геном фага), биологически неактивная форма внутриклеточного существования бактериофага. Профаг, который стал частью бактериальной хромосомы, вместе с ней и реплицируется, не вызывая лизиса, и может передаваться по наследству всем дочерним клеткам.

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой. Взаимодействие происходит, когда бактериальная клетка имеет специфические рецепторы. Начинается взаимодействие с адсорбции вируса на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл. Лизоцим бактериофага растворяет оболочку бактериальной клетки и благодаря сокращению чехла фаговая нуклеиновая кислота проникает в клетку. Бактериофаги – вирусы, поэтому происходит подчинение генетического аппарата бактериальной клетки фаговой нуклеиновой кислоте. Начинают синтезироваться компоненты фага: ранние, поздние белки, нуклеиновые кислоты. Синтез этих компонентов происходит в разных частях клетки и в разное время – разобщённый или дизъюнктивный процесс.

Образовавшиеся компоненты бактериофага собираются в фаговую частицу путём заполнения пустых капсидов нуклеиновой кислотой фага. Образуется фаговая частица. Затем с помощью фермента лизоцима бактериальная клетка лизируется, и бактериофаги выходят наружу. Выход составляет 100 – 200 фаговых частиц, средний цикл – 40 минут, у разных видов колеблется от 30 до 80 минут.

По специфичности взаимодействия с чувствительными клетками выделяют фаги:

1. вирулентные

2. умеренные

Вирулентные фаги существуют в двух жизненных формах: зрелая – внеклеточная (бактериофаг бактериологически инертен); вегетативная – внутри клетки.

Умеренные фаги имеют 3 формы:

4. зрелый (внеклеточный)

5. вегетативный

6. профаг

Умеренные бактериофаги, попав в бактериальные клетки, лизируют не все клетки популяции. С частью клеток они вступают в симбиоз. ДНК фага встраивается в хромосому бактерий. Это состояние называется профаг (геном фага), биологически неактивная форма внутриклеточного существования бактериофага. Профаг, который стал частью бактериальной хромосомы, вместе с ней и реплицируется, не вызывая лизиса, и может передаваться по наследству всем дочерним клеткам.

Лизогения – явление симбиоза бактериофага и лизогенной культуры бактерий. Это понятие отражает способность бактериофага самопроизвольно или под действием физических, химических или биологических факторов исключаться из состава бактериальной хромосомы и запускать продуктивную фаговую инфекцию.

Лизогенная культура обладает следующими свойствами:

1. В лизогенном штамме все клетки лизогенные.

2. Лизогенные культуры устойчивы к действию вирулентного фага.

3. Лизогенные культуры устойчивы к действию антифаговых сывороток.

Могут приобретать дополнительные свойства. Это явление называется лизогенная конверсия. Пример: приобретение культурой нетоксигенной дифтерийной палочки способности продуцировать токсин.

Культивируют бактериофаги в жидких и плотных питательных средах, в которые засеяны соответствующие культуры бактерий. Существуют 2 метода титрования бактериофагов: метод по Аппельману (в жидкой питательной среде) и по Грациа (на плотной среде).

По Аппельману, титром в жидкой питательной среде называется то максимальное разведение, которое даёт полный лизис бактерий.

По Грациа, титр – количество активных фаговых частиц в пересчёте на 1 мл неразведённого фага. Количество активных фаговых частиц в 1 мл = количество зон лизиса * величина обратного разведения. Метод по Грациа более точный.

Для приготовления биопрепаратов из бактериофагов используют в основном три источника: лизогенные культуры бактерий, фекалии выздоравливающих больных, сточные воды. Для выделения дизентерийного бактериофага в сочных водах сначала проводят его индикацию методом фаговой дорожки. На чашку Петри с МПА засевают газоном культуру дизентерийных бактерий, затем на поверхность посева закапывают фильтрат сточной воды стекающей каплей. Посевы инкубируют в термостате в течение 18 часов. При положительном ответе проводят определение исходного титра бактериофага по Аппельману. Для титрования фага готовят его десятикратные разведения, в которые добавляют эталонную культуру дизентерийных бактерий (2 млрд. м. т. в 1 мл). Пробирки помещают в термостат на сутки. Учитывают исходный титр бактериофага. По Грациа, готовят десятикратные разведения фага, которые смешивают со стандартной культурой дизентерийных бактерий в объёме 0,1 мл каждое разведение бактериофага и расплавленным и слегка остуженным агаром. Полученную смесь выливают на чашку Петри с МПА вторым агаровым слоем и после застывания смеси инкубируют в термостате 24 часа. Подсчитывают количество «негативных колоний» бактериофага, умножают на степень разведения фага и объём из расчёта на 1 мл. Это и будет титр бактериофага по Грациа.

Дата добавления: 2014-01-04