Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Методы культивирования и титрования бактериофагов (по Грациа и Аппельману)

Читайте также:
  1. III. Методы отдельных навесок и пипетирования.
  2. Амортизация основных средств и методы ее начисления в целях бухгалтерского учета.
  3. Амортизация основных средств и методы ее начисления в целях налогового учета.
  4. Аналитический учет материалов на складах и в бухгалтерии. Методы аналитического учета материалов
  5. Аппаратные методы защиты
  6. Асептика и антисептика. Стерилизация и дезинфекция. Определение понятий, методы, область применения.
  7. АЮРВЕДИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ТЕРАПИИ. МЕТОДЫ РЕИНТЕГРАЦИИ 33
  8. Бизнес-планирование: понятие, цели, этапы и методы.
  9. Биохимические методы переработки и использования отходов производства и потребления
  10. В остальном методы защиты не отличаются от защиты от ЭМП промышленной частоты.
  11. В. Некоторые методы, используемые при изучении мотивации.
  12. ВИДЫ И МЕТОДЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ

Классификация фагов по характеру взаимодействия с бактериальной клеткой (умеренные и вирулентные). Лизогения и лизогенная конверсия.

Бактериофаги, их природа, строение, формы существования (вегетативный фаг, зрелый фаг, профаг).

Бактериофагия (от греч. phagos – пожирающий) – действие бактериофага («пожиратель» бактерий), заканчивающееся лизисом бактерий. Бактериофаг (фаг) – вирус бактерий. Номенклатура фагов основана на виде хозяина. Фаг, лизирующий дизентерийные бактерии, – дизентерийный бактериофаг, сальмонеллы – сальмонеллёзный фаг, дифтерийные бактерии – дифтерийный фаг.

Морфология и химический состав бактериофагов.

Наиболее изучены фаги кишечных палочек – T-чётные фаги (T – типовые). Фаг Escherichia coli.

Большинство имеют форму сперматозоида. Могут быть кубические или нитевидные. Размеры от 20 до 80 нм, у нитевидных фагов – до 800 нм. Состоят из икосаэдральной головки и хвоста.

Головка содержит нуклеиновую кислоту (ДНК, редко РНК), несущую генетическую информацию, снаружи покрыта белковым капсидом. Если головка имеет кубический тип симметрии, то хвост – спиральный тип. Хвостовой отросток внутри полый, имеет стержень, покрыт чехлом, заканчивается 6-угольной базальной пластиной, от которой отходят 6 шипов и 6 нитей (фибрилл). Нити выполняют адсорбционную функцию. Капсид и чехол отростка состоят из полипептидных субъединиц.

Функции чехла: защита и участие в передаче вирусной ДНК бактерии.

Функции головки: хранение и передача патогенных свойств.

Резистентность фагов.

По сравнению с вирусами более устойчивы. Эфир, этиловый спирт не инактивируют их. Чувствительны к формалину и кислотам. Длительно сохраняются при низких температурах и высушивании. Инактивируются при температуре выше 65˚ C.

Морфологические типы бактериофагов.

1. Нитевидные

2. Фаги с аналогом отростка

3. Фаги без отростка

4. Фаги с коротким отростком

5. Фаги с несократимым чехлом отростка

6. Фаги с сокращаемым чехлом отростка

Фаги:

1. ДНК-содержащие

2. РНК-содержащие

Большинство фагов содержат двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо, но могут быть однонитевые. Внутри фага есть белки: геномные белки и ферменты – лизоцим и АТФ-аза.

Умеренные фаги имеют 3 формы:

1. зрелый (внеклеточный)

2. вегетативный

3. профаг

Умеренные бактериофаги, попав в бактериальные клетки, лизируют не все клетки популяции. С частью клеток они вступают в симбиоз. ДНК фага встраивается в хромосому бактерий. Это состояние называется профаг (геном фага), биологически неактивная форма внутриклеточного существования бактериофага. Профаг, который стал частью бактериальной хромосомы, вместе с ней и реплицируется, не вызывая лизиса, и может передаваться по наследству всем дочерним клеткам.



Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой. Взаимодействие происходит, когда бактериальная клетка имеет специфические рецепторы. Начинается взаимодействие с адсорбции вируса на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл. Лизоцим бактериофага растворяет оболочку бактериальной клетки и благодаря сокращению чехла фаговая нуклеиновая кислота проникает в клетку. Бактериофаги – вирусы, поэтому происходит подчинение генетического аппарата бактериальной клетки фаговой нуклеиновой кислоте. Начинают синтезироваться компоненты фага: ранние, поздние белки, нуклеиновые кислоты. Синтез этих компонентов происходит в разных частях клетки и в разное время – разобщённый или дизъюнктивный процесс.

Образовавшиеся компоненты бактериофага собираются в фаговую частицу путём заполнения пустых капсидов нуклеиновой кислотой фага. Образуется фаговая частица. Затем с помощью фермента лизоцима бактериальная клетка лизируется, и бактериофаги выходят наружу. Выход составляет 100 – 200 фаговых частиц, средний цикл – 40 минут, у разных видов колеблется от 30 до 80 минут.

По специфичности взаимодействия с чувствительными клетками выделяют фаги:

1. вирулентные

2. умеренные

Вирулентные фаги существуют в двух жизненных формах: зрелая – внеклеточная (бактериофаг бактериологически инертен); вегетативная – внутри клетки.

Умеренные фаги имеют 3 формы:

4. зрелый (внеклеточный)

5. вегетативный

6. профаг

Умеренные бактериофаги, попав в бактериальные клетки, лизируют не все клетки популяции. С частью клеток они вступают в симбиоз. ДНК фага встраивается в хромосому бактерий. Это состояние называется профаг (геном фага), биологически неактивная форма внутриклеточного существования бактериофага. Профаг, который стал частью бактериальной хромосомы, вместе с ней и реплицируется, не вызывая лизиса, и может передаваться по наследству всем дочерним клеткам.

Лизогения – явление симбиоза бактериофага и лизогенной культуры бактерий. Это понятие отражает способность бактериофага самопроизвольно или под действием физических, химических или биологических факторов исключаться из состава бактериальной хромосомы и запускать продуктивную фаговую инфекцию.

Лизогенная культура обладает следующими свойствами:

1. В лизогенном штамме все клетки лизогенные.

2. Лизогенные культуры устойчивы к действию вирулентного фага.

3. Лизогенные культуры устойчивы к действию антифаговых сывороток.

Могут приобретать дополнительные свойства. Это явление называется лизогенная конверсия. Пример: приобретение культурой нетоксигенной дифтерийной палочки способности продуцировать токсин.

 

 

Культивируют бактериофаги в жидких и плотных питательных средах, в которые засеяны соответствующие культуры бактерий. Существуют 2 метода титрования бактериофагов: метод по Аппельману (в жидкой питательной среде) и по Грациа (на плотной среде).

По Аппельману, титром в жидкой питательной среде называется то максимальное разведение, которое даёт полный лизис бактерий.

По Грациа, титр – количество активных фаговых частиц в пересчёте на 1 мл неразведённого фага. Количество активных фаговых частиц в 1 мл = количество зон лизиса * величина обратного разведения. Метод по Грациа более точный.

Для приготовления биопрепаратов из бактериофагов используют в основном три источника: лизогенные культуры бактерий, фекалии выздоравливающих больных, сточные воды. Для выделения дизентерийного бактериофага в сочных водах сначала проводят его индикацию методом фаговой дорожки. На чашку Петри с МПА засевают газоном культуру дизентерийных бактерий, затем на поверхность посева закапывают фильтрат сточной воды стекающей каплей. Посевы инкубируют в термостате в течение 18 часов. При положительном ответе проводят определение исходного титра бактериофага по Аппельману. Для титрования фага готовят его десятикратные разведения, в которые добавляют эталонную культуру дизентерийных бактерий (2 млрд. м. т. в 1 мл). Пробирки помещают в термостат на сутки. Учитывают исходный титр бактериофага. По Грациа, готовят десятикратные разведения фага, которые смешивают со стандартной культурой дизентерийных бактерий в объёме 0,1 мл каждое разведение бактериофага и расплавленным и слегка остуженным агаром. Полученную смесь выливают на чашку Петри с МПА вторым агаровым слоем и после застывания смеси инкубируют в термостате 24 часа. Подсчитывают количество «негативных колоний» бактериофага, умножают на степень разведения фага и объём из расчёта на 1 мл. Это и будет титр бактериофага по Грациа.

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
| Методы культивирования и титрования бактериофагов (по Грациа и Аппельману)

Дата добавления: 2014-01-04; Просмотров: 3397; Нарушение авторских прав?;


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



ПОИСК ПО САЙТУ:


Читайте также:



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2017) год. Не является автором материалов, а предоставляет студентам возможность бесплатного обучения и использования! Последнее добавление ip: 54.198.28.114
Генерация страницы за: 0.009 сек.