Методы выделения биологических мембран

Функции биомембран

Основные функции, присущие биомембранам в клетке, состоят в следующем:

1. Мембраны представляют собой полупроницаемые барьеры – защитная функция для клеток и внутриклеточных органелл.

2. Мембраны осуществляют избирательный транспорт различных веществ внутрь клетки и из нее.

3. Передача информации посредством гормонов, медиаторов, нервного импульса.

4. Преобразование энергии (синтез АТФ осуществляется на внутренних мембранах митохондрий за счет энергии трансмембранного градиента концентраций протонов.)

5. Процессы молекулярного узнавания происходят на мембранах клеток, где располагаются рецепторы гормонов, молекулы иммунной системы.

6. Ферментативная деятельность мембран связана с координацией всех биохимических реакций, протекающих в клетке. Кроме основных, существуют и другие специальные функции мембран (мембраны кишечника, органов чувств, хлоропластов).

Исследование мембран начинается с их выделения из природных источников и очистки от других клеточных компонентов. Для каждого типа клеточных мембран нужно подобрать условия препаративного выделения и очистки.

1. Процесс выделения клеток начинается с разрушения тканей и клеток, обычно путём гомогенизации. При работе с животными клетками этот процесс проводят в гомогенизаторах со стеклянными стенками и тефлоновым пестиком. При этом клетки разрушаются за счет сдвиговых усилий при продавливании суспензии через узкий зазор между пестиком и стенкой гомогенизатора. При такой обработке “срывается” плазматическая мембрана и разрушаются связи между различными органеллами при сохранении их целостности. Для разрушения клеток, имеющих стенку (таких как бактерии, клетки грибов и растительные клетки), требуются более жесткие условия. Например, обработка ферментами и буферами, растирание клеток в присутствии абразивных материалов, обработка ультразвуком и экструзия. Большое значение при разрушении клеток имеет правильный выбор среды. Для того чтобы сохранить целостность мембранных органелл, следует использовать среду, изоосмотичную их внутреннему содержимому. Чаще всего для этого используют раствор 0.25 – 0.30 М сахарозы.

2. Разделение мембран в настоящее время чаще всего осуществляют различными методами центрифугирования. Мембранные частицы можно разделить по скорости их седиментации или по плавучей плотности. Первый метод называют зональным центрифугированием, и разделение происходит в соответствии со значениями коэффициента седиментации S; а второй – изопикническим центрифугированием, и разделение происходит в условиях равновесной плотности. На практике обычно применяют некий гибрид этих двух методов.

Для выделения мембран из клеточных гомогенатов используют и другие методы:

- Фазовое распределение. Разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их поверхностными свойствами – с этой целью формируют два или три несмешивающихся слоя водных растворов различных полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, фиколла), и

мембранные частицы разделяются в соответствии с их сродством к этим фазам.

- Непрерывный электрофорез в свободном потоке. В этом случае разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их электрическим зарядом.

- Аффинная адсорбция. Разделение основано на биоспецифическом взаимодействии между мембранными компонентами и твердой фазой, к которой ковалентно присоединены антитела. Чаще всего метод используют для выделения мембранных белков.

- Использование микрогранул силикагеля. Этот подход разработан

специально для выделения плазматических мембран. Катионизированные микрогранулы силикагеля прочно адсорбируются на наружной поверхности плазматической мембраны интактных клеток, и фракция плазматических мембран, связанных с гранулами, легко отделяются в градиенте плотности сахарозы от других мембран за счет более высокой плотности гранул.

3. Определение чистоты мембранных фракций: наиболее объективным критерием чистоты выделенной мембранной фракции является присутствие в ней какого-либо уникального компонента, который содержится только в этой мембране или является в ней преобладающим. Обычно такими компонентами служат ферменты, называемые в этом случае маркерами. В ряде случаев более удобными мембранными маркерами являются специфические рецепторы лектинов, гормонов, токсинов или антител. Кроме того, если мембранная система хорошо охарактеризована, о чистоте можно судить по ее белковому составу. В некоторых случаях препарат характеризуют с помощью электронной микроскопии; а также по содержанию холестерина.

Среди жидкофазных мембранных процессов различают диализ, электородиализ, ультрафильтрацию, обратный осмос.

Дата добавления: 2014-01-04