Фиксированные препараты микроорганизмов

Вводные пояснения. В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Под фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами (в целях безопасности).

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжиривания стекол используют смесь этилового спирта и серногоэфира в соотношении 1:1. Эти операции проводят вдали отгорелок. Прокаленной бактериологической иглой из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю волы. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см².

В случае, если суспензия густая, ее сначала разводят водой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоемпо стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко надпламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажающей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют.

Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки при исследовании формы клеток или при помощи химических соединений для изучения внутренней структуры клеток. В первом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки. Во втором случае используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон.

Один из распространенных приемов фиксации — обработка препарата 96%-ным спиртом или смесью равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова). Для этого препараты погружают на 10—30 мин в фиксирующую жидкость.

Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьирует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски.

При простой окраске используют какой-либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка.

При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраски спор.

Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с веществами основной природы, вторые — кислотной природы. Поскольку в белках есть и основные (NH₂^- и кислотные (СООН^-) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями.

Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют: красные — нейтральный красный, сафранин, фуксин, гематоксилин; синие — виктория, метиленовый синий; фиолетовые — генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые — янус зеленый, метиленовый зеленый, малахитовый зеленый; коричневые — везувин, хризоидин; черные — индулин.

Кислые красители могут быть следующие: красные и розовые — кислый фуксин, эритрозин; черные — нигрозин; желтые — конго, пикриновая кислота, флуоресцин.

Основные красители интенсивнееокрашивают объемв более щелочной среде, кислые — в более кислой. Чтобы различить растворы кислых или основных красителей, в нихпогружают полоски фильтровальной бумаги. Они несутотрицательный электрический заряд. В случае основного окрашивающего раствора его катионы, обуславливающие окрашивающуюспособность, фиксируются отрицательным зарядом бумаги. и по ней вследствие капиллярности будет распространяться только вода (в виде бесцветной полосы). Если раствор содержит кислый краситель, его анионы будут подниматься по бумаге и окрасят ее.

Окрашивание живых клеток микроорганизмов (витальная окраска) — очень трудоемкий процесс и поэтомуиспользуется в микробиологии редко. Микробные клетки фиксируютне только в целях безопасности (если культуры патогенны) или закрепления их настекле, но и для того, чтобы они могли более интенсивно поглотить краситель. Предполагают, что при фиксировании увеличиваетсячисло свободныхамино - и карбоксильных групп, в результате повышается сродство клетки к красителю.

Красители можно разделить на позитивные и негативные.

Позитивные красители окрашивают непосредственноклетки микроорганизмов и другие объекты. Из красителей, применяемых в микробиологии, большинство относится к позитивным. Они окрашивают клетки при комнатнойтемпературе в течение 30—60 с.

Негативные красители окрашивают пространство, окружающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядятсилуэтами на окрашенном фоне.

Некоторые микроорганизмы (например, спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь), плохо выявляемыес помощью позитивных красителей, хорошо прокрашиваютсянегативными красителями. Споры без соответствующей обработки не прокрашиваются, и поэтому при окрашиванииклеток бацилл позитивными красителями они имеют видпреломляющих свет включений в вегетативных клетках.

Дата добавления: 2014-01-04