Материалы и оборудование. Это наименее дифференцированные формы актиномицетов

Грибы

Микобактерии

Нокардии

Это наименее дифференцированные формы актиномицетов. Воздушный мицелий у них отсутствует или развит слабо. На питательных средах развиваются колонии тестообразной (мягкой) консистенции с характерным мицелиальным ободком. Окраска их так же разнообразна, как и у нокардиеформных актиномицетов. В молодом возрасте проактиномицеты образуют мицелий, который вскоре начинает септироваться (в нитях образуются перегородки) и расчленяться на палочковидные фрагменты, в дальнейшем переходящие в укороченные палочки, но чаще — в кокки.

Для знакомства с проактиномицетами можно воспользоваться чистой культурой Nocardia rubra, образующей красные (от лат. ruber — красный) колонии (рис. 5, б).

Это палочковидные, иногда ветвящиеся, образующие подобие мицелия бактерии (рис. 5, в). Настоящего мицелия микобактерии не имеют. Колонии тестообразной консистенции, продуцируют пигмент. В молодой культуре формируются палочки искривленной формы с неровным контуром — звездообразные, иногда довольно длинные, с боковыми отростками. В старых культурах ветвистые палочки часто распадаются сначала на более короткие палочки, затем — на кокки.

Объектами микробиологии служат многие виды микроскопи­ческих грибов. С некоторыми их представителями знакомятся на практических занятиях.

Грибов относят к эукариотам. Тело гриба состоит из мицелия, или грибницы, — сплетения тонких ветвящихся ни­тей — гиф.

Зигомицеты. Низшие грибы, имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий. Размножаются как поло­вым путем, так и бесполым, т. е. при помощи спор.

Представитель класса — мукор (Mucor mucedo) развивает­ся в виде войлочного белого или серого налета на продуктах растительного происхождения и навозе травоядных животных.

Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и час­тично стелется по его поверхности. Вверх от грибницы отходят особые воздушные гифы — спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Вздутия представляют собой спорангии, в дальнейшем они отделяются от спорангиеносцев перегородкой. В споран­гиях бесполым путем образуются многочисленные спорангиоспоры — эндоспоры (от греч. endon — внутри).

Перегородка, отделяющая спорангий от спорангиеносца, расположена куполообразно, поэтому верхняя часть спорангиеносца оказывается внутри спорангия. Этот участок спорангиеносца называется колонкой и у разных видов мукоровых грибов имеет различную форму (грушевидную, шаровидную, цилиндрическую).

Для просмотра мукоровых грибов следует осторожно взять препаровальной иглой небольшое количество мицелия и другой препаровальной иглой снять его на сухое предметное стекло. Препарат сначала рассматривают без покровного стекла при малом увеличении микроскопа. Видны спорангиеносцы и круглые темные шарики на их концах — спорангии. Обычно они покрыты тонкими шипами из кристаллов оксалата кальция. Затем на поверхность препарата наносят каплю воды, накры­вают его покровным стеклом. Оболочка спорангия при этом разрушается, и споры выпадают. Препарат рассматривают по­следовательно при малом и большом увеличениях (без им­мерсии).

Представители рода Мисоr (рис. 6, а) могут быть выделе­ны из почвы при посеве пылевидных ее частиц на поверхность сусло-агара в чашках Петри или из свежего конского навоза, помещенного на 3—4 дня под стеклянный колпак на тарелку с влажной фильтровальной бумагой или сырым песком.

Рисунок6 - Грибы микроскопические: а — Мисоr, б — Aspergillus, в — Рenicillium; г — Fusarium, конидиеносец с конидиями: 1 — макроконидии, 2 — микроконидии; д — Trichoderma (кони-диеносцы с головками конидий; е — Alternaria, конидиеносцы с цепочками конидий.  

Аскомицеты, или сумчатые грибы. Высшие грибы с многоклеточным или членистым мицелием, образующие споры в сумках — асках. Они включают представителей эуаскомицетов (истинных аскомицетов), у которых сумки со спорами формируются в результате полового процесса на поверхности или внутри плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия, возможно бесполое размножение экзогенно (возникающими спорами —

конидиям) и гемиаскомицетов, у которых плодовые тела отсутствуют. К гемиаскомицетам относят большинство дрожжей, рассматриваемых отдельно.

Эуаскомицеты включают дна важнейших рода почвенных грибов — Penicillium и Aspergillus, которых нередко называют также плесневыми грибами. К группе плесневых относят и некоторых представителей зигомицетов и несовершенных грибов.

Пенициллы и аспергиллы имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий. Размножаются преимущественно конидиальным спороношением. Наблюдаются в виде налета голубого, зеленого, сизого, реже других цветов на продуктах растительного происхождения (варенье, томатной пасте, лимонах и апельсинах), отсыревших изделиях из кожи, обоях. Распространены в верхних горизонтах почвы.

Грибы рода Penicillium (рис. 6, в) называют кистевиками, так как они образуют конидии на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоминающих кисть руки. Иногда отдельный пучок конидиеносцев, выходящих из одной точки и отчленяющих конидии, напоминает рисовальные кисти.

Для рассмотрения строения конидиеносцев Penicillium glaucum препаровальной иглой вырезают кусочек мицелия (приблизительно 0,5 мм²) на границе между его зеленым и белым участками. (Гриб к занятию выращивают в чашке Петри; старые грибы с полностью зеленым мицелием не годятся для просмотра.) Осторожно с помощью двух препаровальных игл кусочек мицелия снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло. Сверху на мицелий кладут покровное стекло. Поскольку мицелиальная пленка гриба довольно толстая, может получиться так, что под покровным стеклом вода не будет целиком окружать исследуемый мицелий. В этом случае надо из капельницы добавлять воду под покровное стекло до тех пор, пока кусочек мицелия не будет со всех сторон окружен водой. Затем слегка надавливают на покровное стекло в центре стеклянной палочкой (или препаровальной иглой). Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой.

Препарат сначала просматривают при малом увеличении, уделяя основное внимание его краям, так как на них обычно хорошо видны кисти конидиеносцев. Когда подходящий участок найден, переходят с объектива 8^× на объектив 40^× и детально рассматривают кисточки. Но время просмотра при малом увеличении конденсор опускают, при переводе на объектив 40^× снова регулируют освещенность поднятием конденсора.

Aspergillus, или леечная плесень (рис. 6, б), имеет обычно одноклеточные конидиеносцы шаровидно, булавовидно или грушевидно вздутые. На них располагаются параллельно друг другу короткие кеглеобразные стеригмы, каждая из которых отшнуровывает радиально цепочки конидий. Некоторые виды аспергиллов имеют два ряда стеригм. Вся головка конидиеносца с радиально расходящимися цепочками конидий напоминает наконечник лейки со струйками воды.

Для ознакомления со строением конидиеносцев аспергилла на примере Aspergillus niger препаровальной иглой берут небольшое количество мицелия на границе между черным и коричнево-бурым участками колонии и вносят в каплю воды на предметном стекле. Далее поступают так же, как и при просмотре пеницилла. В начальной стадии спорообразования Aspergillus похож на Мисоr (бесцветные головки), затем с возрастом головки покрываются стеригмами, на которых развиваются споры. В результате получаются так называемые кудрявые головки. От мукора аспергилл всегда можно отличить наличием таких головок. У мукора головки гладкие — «лысые», так как споры его эндогенного происхождения (внутренние), а у аспергилла и пеницилла — экзогенные споры (внешние).

Дейтеромицеты, или несовершенные грибы. Имеют многоклеточный мицелий, но у них нет полового процесса и совершенной стадии спороношения. Размножаются бесполым путем при помощи конидий или вегетативно участками гифов. В природе широко распространены представители родов Fusarium, Trichoderma, Alternaria, которых формально относят к дейтеромицетам. Встречаются они на растительных остатках, плодах, семенах и в почве.

Среди грибов рода Fusarium (рис. 6, г) есть сапротрофы, живущие в почве и на растительных остатках, и паразиты, вызывающие заболевания многих видов растений (увядание, гнили корней, стеблей, плодов, полегание сеянцев древесных и кустарниковых пород, болезни семян, различные пигментации органов растений).

Колонии отдельных видов фузариума на питательных средах (на сусло-агаре) разнообразны по структуре: они могут быть рыхлыми, ватообразными, пушистыми, паутинистыми или плотными пленчатыми. Колонии бывают белые или различных тонов розового или желтого цветов. Нередко питательная среда также окрашивается в разные цвета и оттенки от розового до коричневого.

Фузариумы характеризуются большим разнообразием ферментов, благодаря которым могут использовать в качестве источников питания различные вещества, некоторые виды даже способны усваивать клетчатку.

Приготовив в капле воды препарат обычным способом и рассматривая его под микроскопом, можно увидеть более или менее разветвленные конидиеносцы и очень характерные для фузариума конидии, так называемые макроконидии. Они заострены на концах, продолговатые, согнутые, нередко серповидные, с несколькими перегородками (напоминают бананы). У многих видов фузариума образуются, кроме того, овальные мелкие бесцветные, чаще одноклеточные, микроконидии.

Грибы рода Trichoderma нередко можно обнаружить на коре, древесине, засохших листьях и стеблях, а также на семенах различных трав, кустарников и деревьев: их легко выделить из почвы на подкисленном сусло-агаре. Через 2—3 дня инкубации при 23—25°С на поверхности среды появляется сначала белый, затем с оттенками зеленовато-желтого цвета рыхлоклочковатый или войлочный налет, образованный мицелием и скоплением конидиеносцев. С возрастом он становится темно-зеленым. При большом увеличении микроскопа видны прямостоячие, многократно супротивно разветвленные конидиеносцы, приподнимающиеся над мицелием. На вершине конидиеносцев расположены шаровидные головки, каждая из которых состоит из 10—20 одноклеточных бесцветных конидий. Представители этого рода энергично разрушают белковые соединения и разнообразные углеводы. Обладая антибиотическими свойствами в отношении других грибов, в том числе паразитических, триходерма выполняет оздоровляющую функцию в почве.

Разные виды рода Alternaria можно выделить с листьев пораженных этим грибом растений картофеля или томата, с семян капусты и других растений, из почвы. Они характеризуются своеобразным (обратнобулавовидным) строением многоклеточных грушевидных конидий, соединенных цепочками. У каждой — 3—9 поперечных и одна или несколько продольных перегородок. Конидиеносцы, являясь боковыми ответвлениями мицелия, имеют вид простых или слаборазветвленных одноклеточных, иногда многоклеточных веточек. Колонии на сусло-агаре сначала светлые, пушистые, затем зеленовато-серые или оливково-черные, бархатистые или ворсистые, нередко с ясно выраженной концентрической зональностью; иногда колонии с самого начала сажисто-черные, уплощенные, во многих случаях темный пигмент диффундирует в среду.

Дрожжи. По современным представлениям, дрожжи — это сборная группа одноклеточных микроскопических организмов, относящихся к разным классам грибов, преимущественно — к классу аскомицетов.

Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразна: элипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая. Размножаются вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения — почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам (рис. 7. а) относятся представители «культурных» дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты), к делящимся — виды рола Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относятся к классу несовершенных грибов.

С делящимися дрожжами (рис. 7, б) можно познакомиться на примере Schizosaccharomyces pombe (schizo — рваться, делиться, saccharomyces — сахарный гриб, pombe — название африканского напитка, из которого этот организм выделен). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род дрожжей является отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, связанным со спорообразованием, что характерно для сумчатых грибов. Schizosaccharomyces pombe рассматривают на фиксированных, окрашенных фуксином препаратах. Это цилиндрической формы крупные клетки с округлыми концами. Размножение делением свойственно также дрожжам рода End omyces. Из почкующихся дрожжей наиболее "одомашнены» дрожжи пекарские — Saccharomyces cerevisiae. Форма их разнообразна. Размножаются они почкованием (вегетативный способ размножения) и аскоспорами. При почковании на материнской клетке возникает маленькая выпуклость — почка — дочерняя клетка, в которую переходит одно ядро. Клетка увеличивается в размерах и отделяется. Если условия для такого размножения благоприятны (достаточное количество сахара, соответствующая температура, аэрация), процесс идет очень быстро. У некоторых представителей рода клетки после почкования не успевают разъединяться, и возникает псевдомицелий (ложный мицелий).

Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помешают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях.

В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая — удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение.

С представителями аспорогенных дрожжей, размножающихся только почкованием и не образующих спор, можно познакомиться на примере Candida kefiri. Их клетки мелкие, диаметром около 5 мкм.

Размножение у дрожжеподобных организмов может происходить также в результате распада гиф на отдельные клетки — оидии, или артроспоры, как у Geotrichum candidum (Oidium lactis).

Коллекцию культур следует пересевать каждые 2-3 месяца на свежие питательные среды: бактерии и актиномицеты - на мясопептонный агар, дрожжевые и плесневые грибы на сусло-агар. За 2- 3 дня до занятий культуры пересевают в пробирки (бактерии и актиномицеты) или чашки Петри (грибы) из расчета по дне пробирки каждой культуры и одну-две чашки Петри на группу студентов из 10-15 человек.

Для занятий необходимы микроскопы и все принадлежности к ним; предметные и покровные стекла; бактериологические петли (иглы); препаровальные иглы; свежий 5%-ный раствор фуксина.

3.2. Цитохимические методы исследования микроорганизмов

Микробная клетка — сложная живая система, характеризующаяся высокой степенью упорядоченности составляющих ее структур. Каждая такая структура имеет определенную жизненную функцию, а взаимодействие отдельных структур между собой обеспечивает существование клетки, ее целостность.

Для изучения внутреннего строения клеток применяют специальные способы окраски — цитохимические методы исследования. Многие из этих методов преследуют диагностические цели. По форме клетки микроорганизмов не слишком разнообразны, и в ряде случаев, чтобы установить их принадлежность к тому или иному роду и виду, необходимо провести специальное окрашивание клетки или вещества, накапливающегося в ней.

Дата добавления: 2014-01-04