Молочнокислое брожение

Материалы и оборудование

Питательная среда с сахарозой, дрожжи, плоскодонные колбы на 250 мл с затвором Мейссля, весы и разновесы, цилиндры на 100 мл, этикетки, колба на 700—800 мл, отгонный аппарат Либиха, микроскопы и все необходимое для микроскопирования; пробирки, 20%-ный раствор Na₂CO₃, кристаллический иод, небольшой стеклянный шпатель и водяная баня.

Вводные пояснения. Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения овощей, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр; кислый вкус черного хлеба определяется молочной кислотой. Данные процессы вызывают молочнокислые бактерии, которые разнообразны и широко распространены в природе.

Молочнокислые бактерии обитают на поверхности растений, в молоке, на пищевых продуктах, в кишечнике человека и животных. Они имеют много общих признаков, важнейшими из которых являются:

· способность к синтезу молочной кислоты;

· грамположительность;

· отсутствие спор;

· неподвижность;

· форма (кокки или палочки);

· требовательность к источникам азота (многие из них не развиваются на простых синтетических средах);

· отсутствие фермента каталазы;

· способность к расщеплению перекиси водорода до воды и кислорода.

Последнее свойство выявляется, если на колонию молочнокислых бактерий нанести каплю 3%-ного раствора перекиси водорода: выделение кислорода при этом не происходит. Колонии бактерий, синтезирующих каталазу, в таких условиях покрываются пузырьками кислорода.

Молочнокислые бактерии можно разделить на две группы:

· гомоферментативные, образующие из сахара в основном одну молочную кислоту

С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СНОНСООН

Глюкоза Молочная кислота

· гетероферментативные, образующие наряду с молочной кислотой значительные количества побочных продуктов

С₆Н₁₂О₆ → СН₃СНОНСООН + СН₃СООН + СН₃СН₂ОН + СО₂

Глюкоза Молочная Этиловый Уксусная Диоксид

кислота спирт кислота углерода

2С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СНОНСООН + ЗСН₃СООН (бифидоброжение)

Молочнокислые бактерии сбраживают моно- и дисахариды. Чаще бактерии, обитающие в молоке, сбраживают лактозу, но никак не воздействуют или слабо воздействуют на сахарозу. Обычно лактоза подвергается гидролизу с образованием глюкозы и галактозы, а затем уже происходит брожение.

Источниками азота для группы молочнокислых бактерий служат пептоны, смесь аминокислот. Большинство нуждается в ряде витаминов.

При изучении молочнокислого брожения лучшая питательная среда — молоко. В нем есть все необходимые для развития молочнокислых бактерий элементы. В такой среде могут развиваться и другие бактерии (гнилостные, маслянокислые), но молочная кислота быстро подавляет их рост.

Критические значения реакции среды (рН) для развития некоторых групп бактерий:

· молочнокислые........4,0—3,5;

· маслянокислые........5,0—4,7;

· гнилостные...............5,5—5,0.

Постановка опыта. Определив начальную кислотность молока титрованием 0,1 н. раствором NaOH, его разливают в колбы Эрленмейера на 100 мл по 40—50 мл и закрывают ватными пробками

Параллельно выполняют второй вариант опыта: разливают молоко в колбы, закрывают ватными пробками, ставят на асбестовые сетки и доводят молоко до кипения.

Колбы с кипяченым и некипяченым молоком помещают в термостат, при 30 С. Через 10—12 ч некипяченое молоко скисает. В колбе образуется ровный плотный сгусток без следов газа (если в опыте используют молоко хорошего качества). Сгусток получается в результате реакции молочной кислоты с казеинатом кальция и выпадения казеиновой кислоты в осадок.

При кипячении молока молочнокислые бактерии, поскольку они не образуют спор, погибают, споры же масляно-кислых бактерий сохраняются. При инкубации в термостате они прорастают и осуществляют маслянокислое брожение лактозы. В результате реакции масляной кислоты с казеинатом кальция и в этом варианте опыта казеиновая кислота выпадает в осадок. В дальнейшем она подвергается пептонизации, в результате чего сыворотка приобретает кремовый цвет, неприятный запах масляной кислоты (запах пота) и прогорклый вкус.

Микроскопирование молочнокислых бактерий. Если простоквашу хранить, при комнатной температуре, то на ее поверхности появляется белая или кремовая бархатистая морщинистая пленка. Такая же пленка обычно бывает на поверхности рассола при квашении огурцов, капусты и других овощей. Это молочная плесень - Geotrichum candidum (Oidium laclis), которая всегда сопутствует молочнокислому брожению, являясь его нежелательным спутником. Она окисляет молочную кислоту, образуемую молочнокислыми бактериями, до СО₂ и H₂O, снижая кислотность среды. В результате кисломолочные и квашеные продукты начинают портиться, так как в среде происходит развитие гнилостных бактерий.

Молочная плесень - аэробная форма, поэтому развивается только на поверхности. Имеет многоклеточный мицелий, который распадается на отдельные клетки, так называемые оидии, по форме напоминающие дрожжи и служащие для размножения.

Для микроскопических наблюдений за молочнокислыми бактериями готовят препарат из прокисшего молока. Бактериологическую петлю вводят в сгусток и, повернув вокруг оси, извлекают, прикасаясь ею к пленке, которую образует молочная плесень. Сгусток размазывают по предметному стеклу очень тонким слоем без воды. Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с эфиром (приблизительно 1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая ее. При такой фиксации не только погибают и прикрепляются к стеклу бактерии, но и с помощью эфира извлекается и удаляется жир, капли которого на препарате мешают окраске и микроскопированию.

Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Метиленовый синий — лучший краситель для молочнокислых бактерий молока, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо — клетки микроорганизмов. На препарате преобладают мелкие округлые клетки Lactococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Эта бактерия — возбудитель естественного скисания молока в средних широтах. Оптимальная температура для ее развития — 30 °С. Она способствует накоплению в молоке до 1% молочной кислоты.

Нередко на препарате видны разных размеров тонкие палочки обычно правильной формы рода Luctobacillus, иногда содержащие зерна волютина. Чаше встречается l.aclobacillus bulgaricus (рис. 16) — возбудитель естественного скисания молока в южных широтах. Оптимальная температура ее развития — 40 °С, она кислотоустойчива, накапливает до 3,5% молочной кислоты. На плотных средах эта бактерия образует мелкие характерные колонии в виде комочков ваты, как правило, выпуклые, непрозрачные, непигментированные.

Если на поверхности прокисшего молока появилась пленка, то в мазке обнаруживается также и молочная плесень (рис. 17). Прямоугольные или овальные клетки ее отличаются от молочнокислых бактерий большими размерами.

Можно приготовить также фиксированные препараты из кисломолочных продуктов (йогурта, кефира, ацидофилина, ряженки, бифидока и др.) и зарисовать доминирующие формы.

Препараты из силоса или квашеной капусты готовят следующим образом: сначала втирают в предметное стекло кусочки силосуемой массы (или капусты), подсушивают и фиксируют над пламенем горелки. Остывший препарат окрашивают эритрозином (он в отличие от фуксина не окрашивает растительные элементы). И в силосе, и в квашеной капусте преобладают тонкие, хорошо прокрашивающиеся палочки L. plantarum.

Определение количества и качественные реакции на молочную кислоту. Количество молочной кислоты устанавливают по разности между объемами 0,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование молока в конце опыта, и при его постановке.

Для титрования берут 5—10 мл (лучше 10мл) свежего или прокисшего молока, помещают его в колбу Эрленмейера на 100 мл, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1—2 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо-розовой окраски. Если на поверхности прокисшего молока образовалась пленка, то, прежде чем взять сгусток, ее сдвигают пипеткой или стеклянной палочкой в сторону, затем разбивают сгусток, постукивая колбой о ладонь.

Кислотность молока выражают в градусах Тернера (°Т) или процентах молочной кислоты. Так, 1 °Т соответствует 1 мл 0,1 н. раствора щелочи, пошедшей на титрование 100 мл молока. Следовательно, если на титрование 10 мл молока пошло х мл щелочи, то для выражения кислотности молока в градусах Тернера нужно значение х умножить на 10.

Чтобы выразить кислотность в процентах молочной кислоты, количество 0,1 н. раствора NaOH (в мл), потраченное на титрование 100 мл молока, умножают на 0,009, так как 1 мл 0,1 н. NaOH нейтрализует эквивалентное количество молочной кислоты. Молекулярная масса молочной кислоты составляет 90. Для приготовления 1 л 1 н. раствора требуется 90 г кислоты. В 1 л 0,1 н. раствора содержится 9 г, а в 1 мл — 0,009 г молочной кислоты.

После определения титруемой кислотности оставшееся скисшее молоко отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. Фильтрат используют для качественных реакций на молочную кислоту.

Для проведения реакции «серебряного зеркала» молочную кислоту превращают в уксусный альдегид. Реакция происходит в кислой среде при температуре кипения в присутствии КМnО₄. Результатом взаимодействия уксусного альдегида с аммиачным раствором серебра является образование металлического серебра (серебристое окрашивание).

Последовательность проведения этой качественной реакции на молочную кислоту следующая. В коническую колбу на 100 мл набирают пипеткой 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на асбестовой сетке до начала кипения, периодически взбалтывая. Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5 мл 5%-ного раствора КМnО₄, который при этом обесцвечивается. В результате молочная кислота превращается в уксусный альдегид.

Происходящие химические реакции можно выразить следующими уравнениями:

2KMnO₄ + 3H₂SO₄ = K₂SO₄ + 2MnSO₄ + ЗН₂О + 5O

5СН₃СНОНСООН + 5О = 5СН₃СНО + 5СО₂ + 5Н₂О

Для распознавания уксусного альдегида горлышко колбы без промедления накрывают фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором AgNO₃.

Аммиачный раствор нитрата серебра готовят следующим образом: к 1—2 мл 10%-ного раствора AgNO₃ в пробирке добавляют по каплям аммиак: сначала появляется осадок Ag₂O, который затем растворяется в избытке аммиака.

Аккуратно, чтобы не разорвать, фильтровальную бумагу прижимают к краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, реагируя с аммиачным раствором AgNO₃, вызывает почернение бумаги, имеющее серебристый оттенок, — это выделяется металлическое серебро.

Другой качественной реакцией на молочную кислоту служит реакция с тиофеном. Для ее проведения в пробирку к 1—2 мл фильтрата прибавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и 0,5 мл насыщенного раствора CuSO₄. Смесь взбалтывают, нагревают 5 мин на водяной бане при 100 °С и после охлаждения добавляют к ней несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора тиофена. В присутствии молочной кислоты наблюдается вишнево-красное окрашивание. Реакция очень чувствительна и специфична.

Дата добавления: 2014-01-04