Определение денитрифицирующей активности почвы

Определение нитрифицирующей активности почвы

Нитрифицирующая и денитрифицирующая активность почвы

Материалы и оборудование

Определение аммонифицирующей активности микроорганизмов

Для определения аммонифицирующей способности микроор­ганизмов по Федорову необходимо приготовить минеральную питательную среду следующего состава (г/л дистиллированной воды): К₂НРО₄ - 2; КН₂РО₄ - 2; MgSO₄ - 0,3. К этой среде добавляют пептон и глюкозу в таких количествах, чтобы соот­ношение С:N было 5:1; 10:1; 15:1; 20:1 и 30:1.

В качестве источника азота можно использовать горохо­вую и люпиновую муку, гуматы и др.

На 100 мл субстрата берут 1 г пептона, содержащего 0,15 г азота и 0,5 г углерода. Для получения соотношения С:N = 5:1 к 100 мл среды добавляют 0,625 г глюкозы; соот­ношения С:N = 10:1 — 1,25 г глюкозы и т. д.

Питательную среду разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера на 300 мл и стерилизуют. Затем среду инфицируют ис­следуемыми микроорганизмами и помещают на 7 суток в термос­тат при28—30°С. Опыт ставят минимум в двух повторностях.

После инкубации накопившийся аммиак определяют диффузионным методомв чашке Кон вея. Параллельно устанав­ливают общее количество выросших клеток методом прямого счета под микроскопом или методом питательных пластин на МПА.

Стерильные колбы Эрленмейера на 250 мл, стерильное сито с ячейка­ми 2 мм, почва, субстрат для аммонификации. 1 н. раствор KCI, бу­мажный фильтр, отгонный аппарат для определения азота микроме­тодом Кьельдаля, чашки Конвея, минеральная питательная среда Фе­дорова с пептоном и глюкозой, МПА, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

Из почвенного образца, просеянного через сито с отверстиями 2 мм, отбирают навеску в 100 г и помещают в стерильную кол­бу Эрленмейера на 250 мл. Почву смачивают до 60% ПВ, до­бавляют к ней 0,1 г (NH₄)₂SO₄ и 0,2 г СаСО₃, перемешивают, закрывают ватной пробкой, взвешивают и помешают в термос­тат при 27—28°С на 30 сут. Контролем служит почва без суль­фата аммония.

Влажность почвы должна быть постоянной. Для этого каждые 7 сут колбы взвешивают и стерильной дистиллирован­ной водой доводят влажность до первоначального уровня (см. 8.2.1).

По окончании опыта определяют нитраты в опытных и контрольных почвах (см. 8.2.1).

При определении денитрифицирующей активности почвы воз­никают большие затруднения, так как способность восстанав­ливать нитраты — не единственная функция денитрифици­рующих бактерий в почве. Эти бактерии могут развиваться и в присутствии молекулярного кислорода, окисляя белки, жи­ры и другие соединения.

Согласно методу Федорова,навеску свежей почвы в 50 г помещают в стерильную колбу на 250 мл, увлажняют ее сте­рильной водой до 60% ПВ и добавляют 0,1—0,2 г нитрата. После 14-дневного компостирования одновременно устанавли­вают количество нитрата, нитрита и аммиака. Сравнивая эти показатели у разных почв, можно выявить их потенциальную денитрифицирующую активность.

Недостаточная точность метода обусловлена прежде все­го длительностью инкубации (14 сут). За такой срок в почве может произойти смена многих процессов, направленность и интенсивность которых зависит от природы образца.

В каждом конкретном случае соотношение анализируе­мых азотсодержащих соединений может быть результатом не только активности денитрификаторов, но и неучтенной актив­ности микроорганизмов других физиологических групп, принимающих участие в трансформации азота.

12.3.3. Определение денитрифицирующей активности и смены процессов в замкнутой системе почва — атмосфера путем применения ацетилена по методу Федоровой

Приденитрификации редукция нитрата идет до газообразных продуктов:

NO₃ → NO₂ → NO → N₂O → N₂.

В опытах с растущими культурами денитрифицирующих микроорганизмов и в условиях их активности в почвах оказа­лось, что небольшие концентрации ацетилена (С₂Н₂) ингибируют редукцию закиси азота (N₂О) денитрификаторами без за­метного угнетения восстановления других продуктов диссими­ляции NO₃^- .

Денитрификация, как доминирующий процесс, закономерно сменяется азотфиксацией. Это обусловлено изменением cooтношения легкодоступного связанного азота и углерода и уровня окислительно-восстановительного потенциала, кото­рый в значительной степени определяемся присутствием нитрата в среде. Активность нитрогиназы подавляется нитратами, и азотфиксаторы, обладая нитрат- и нитритредуктазой, предпочтительнее используют нитраты и нитриты, чем N₂О и N₂.

В замкнутом объёме в этот период происходит накопле­ние N₂О за счет активности денитрификаторов и выделение СО₂, в результате интегральной жизнедеятельности как денитрификаторов, так и азотфиксаторов.

Фиксация N₂ бактериями при наличии достаточного ко­личества источника углерода начинается практически после полной утилизации нитратов и нитритов. Этот момент может быть зафиксирован по появлению в газовой фазе этилена. Ис­пользование в качестве источника углерода глюкозы позволяет дополнительно контролировать нитрогеназную активность по выделению Н ₂ и некоторой убыли N₂.

Принцип методаопределения денитрифицирующей ак­тивности почвы состоит в том, что введение ацетилена¹ в ис­ходную атмосферу дает возможность фиксировать, количество выделившейся закиси азота в процессе диссимиляции NO ₃^- и NO ₂^- (т. е. денитрификации). Накопление N₂O прекращается с исчезновением нитратов и нитритов из субстрата, что совпадает с появлением этилена, свидетельствующего об азотфиксирующей активности бактерий. Анализ газовой фазы на указан­ные компоненты в динамике позволяет определить максималь­ное количество N₂О, образовавшееся в опыте, и рассчитать по нему количество восстановленных до закиси азота нитратов и нитритов. Все необходимые газовые составляющие могут быть идентифицированы на одном детекторе.

Определение проводят в стеклянных сосудах, имеющих боковой отросток, перекрывающийся притёртым стеклянным затвором, и отверстие сверху, которое после внесения в сосуд почвы, глюкозы (13,3 мг на 1 г почвы) и нитрата (0,5 мг KNO₃ на 1 г почвы) в виде растворов закрывается пробкой из сили­коновой резины. Такая пробка позволяет производить много­кратный отбор проб газа без потери герметичности. При от­крытом затворе через боковой отросток с помощью вакуумного насоса, соединенного с манометром, эвакуируют атмосферный воздух и проводят 2—3-кратную промывку содержимого сосуда инертным газом, который вводят с помощью шприца, а затем откачивают через боковой отросток. Для этой цели применяют аргон или гелий, которые соответственно используют в качест­ве основы экспериментальной газовой смеси.

Затем половину сосудов заполняют газовой смесью с l,5 % С₂Н₂, а другую — с 10% С₂Н₂. Большая концентрация С₂Н₂ сильнее тормозит утилизацию N₂O бактериями, что дает возможность надежно фиксировать максимум образовавшегося в процессе денитрификации N₂O и позволяет подстраховать исследователя в том случае, если в вариантах с меньшим со­держанием ацетилена его уловить не удастся.

Газовые смеси готовят в газометрах (за 24 ч до опыта). Количество образовавшегося N₂O рассчитывают по калибро­вочным кривым. Определение всех газовых компонентов (СО₂, N₂O. N₂, Н₂, С₂Н₂, С₂Н₄, СН₄) расширяет возможности метода, позволяет наблюдать смену процессов, обусловленную ак­тивностью отдельных физиологических групп микроорганиз­мов (включая метанообразующие), и изучать воздействие на них отдельных факторов.

Ацетиленовый метод Федоровой позволяет вычленить денитрификацию из всех происходящих в почве метаболиче­ских процессов и количественно оценить его методом газовой хроматографии.

¹ Ацетилен взрывоопасен, поэтому при работе с ним надо соблюдать правила техники безопасности: хранить газ в металлических баллонах или получать из карбида кальция перед опытом.

12.4. Азотфиксирующая активность микроорганизмов

Дата добавления: 2014-01-04