Работа на газовом хроматографе

Определение нитрогеназной активности симбиотических азотфиксирующих бактерий

При определении нитрогеназной активности на интактных клубеньках в пенициллиновый флакон помешают отмытые и просушенные фильтровальной бумагой корни бобового рас­тения с клубеньками. Шприцем вводят ацетилен (10% избы­точного давления ацетилена) и после экспозиции в течение 1 ч в условиях теплицы или других помещений (в зависимости от целей эксперимента) реакцию останавливают введением 1 — 5 мл реактива Несслера, который связывает оставшийся ацети­лен. Образцы можно хранить в холодильнике при 4°С дли­тельное время до анализа на хроматографе.

При определении нитрогеназной активности и интактной бобово-ризобиальной системы осторожно извле­кают растение с клубеньками из почвы или другого субстрата. Очищают клубеньки, стряхивая почву с корней, и помешают растение до корневой шейки в полиэтиленовый пакет. Пакет закрывают резиновой пробкой, предварительно разрезанной вдоль на две половины и имеющей отверстие для стебля расте­ния. Растение размещают так, чтобы надземная часть была расположена над пробкой, а корневая система — в пакете. Ще­ли между отверстием в пробке и стеблем заделывают замазкой.

Воздух из пакета откачивают. Через специальное отверс­тие в пробке шприцем вводят в пакет 50 см³ газовой смеси (15% ацетилена, 20% кислорода и 65% аргона). Газовую смесь готовят непосредственно перед опытом в газометре, представ­ляющем собой сосуд, заполненный 30%-ным раствором NaCl, объем которого равен объему вводимых газов. Через 10— 15 мин шприцем отбирают из газовой смеси образец в 5 мл и переносят его в закрытый шприц-сборник для анализа мето­дом газовой хроматографии.

В полевых условиях при определении азотфиксирующей активности бобово-ризобиальной системы методом «колпа­ков» цилиндр не следует углублять в почву более чем на 10 см, так как основная масса клубеньков локализована в верхнем слое. Колпаки проверяют на герметичность водой. Для обеспе­чения концентрации ацетилена, равной 5—10%, на колпак вы­сотой 60—70 см рекомендуется вносить 35—40 г карбида каль­ция и 20 мл пропана.

Количество образовавшегося в ходе определения азотфикси­рующей активности помпы этилена определяют при помощи пламенно-ионизационного детектора на газовых хроматографах любой марки.

Для разделения газов используют сорбенты ACM, TЗK-M и др. Газами-носителями служат инертные газы аргон, гелий или азот. Количество восстановленного этилена определяют по стандартным пикам, для чего готовят стандартный раствор этилена.

Пример расчёта. В случае, если разведение стандартного рас­твора 1:1000, 1 мл 100%-ного этилена разводят в герметичной емкос­ти на 1 л. Исходя из закона Авогадро, 1 моль газа этилена занимает объем 22,4 л. Рассчитаем, сколько молей занимает интересующий нас объем (0.001 л):

1 моль этилена занимает объем 22,4 л

Х этилена 0,001 л

Х = 1·0,01 ׃ 22,4 = 44,6 ·10^-9(моль) = 44,6 (нмоль).

Вводя в хроматограф данное количество стандартного этилена (1 мл) с известной размерностью (44,6 · 10 ^-9 моль), получаем величину стан­дартной пробы в сантиметрах, относительно которой рассчитывают опытные пробы.

Пробы из опытных образцов вводят в хроматограф и по­лучают величины пиков в миллиметрах на разных шкалах чув­ствительности хроматографа, которые впоследствии приводят к размерности стандартной пробы и к единому объему вводимой пробы.

Для сравнительной оценки активности бобово-ризоби­альной системы ацетиленовым методом данные вычисляют с помощью следующей формулы (в нмолях восстановленного этилена за 1 ч в расчете на одно растение):

где А - количество этилена (С₂Н₂) в нмолях на реакционный флакон (аптечный флакон на 30 мл) в единицу времени; Р₂ — пик диаграммы пробы из реакционного флакона в см (при наличии примеси этилена и исходном ацетилене пик фона вычитают): Р₁ — усредненный пик диаграммы пробы стандарта в см; К₁ — калибровка (чувствительность) прибора при анализе пробы стандарта; К₂ — калибровка прибора при анализе пробы из флакона; V₁ — объем пробы стандарта в см³; V₂ — объем испытуемой пробы из флакона в см³; V₃ — объем реакционного флакона в см³; t — время экспозиций в ч; n — число корней во флако­не; 44,6 — количество С₂Н₂ (нмоль в 1 см³) в пробе стандарта.

Работу следует нести при одинаковой калибровке (чувст­вительности) прибора при анализе проб из флакона и стандар­та, тогда К₂ / К₁ = 1. Лучше, если объемы проб из стандарта и флакона равны, например составляют 0,5 мл. Тогда V₁ / V₂ = 1. В каждый флакон следует «водить ацетилен в количестве, равном 5% объема флакона (так, во флакон на 30 мл вводят 2 см³ ацетиле­на, на 130 мл— 6 см³ ацетилена). Время экспозиции — 1 ч. Для этих условий формула (1) приобретает вид:

(2)

Вследствие того что в каждой анализируемой партии об­разцов величины V₃ (объем флакона) и Р₁ (средняя величина пиков стандарта для всех определений) одни и те же, число корней также равное, формула еще более упрощается:

(3)

Таким образом, для определения количества С₂Н₄ в нмолях, образовавшегося во флаконе за 1 ч в расчете на 1 растение, пик диаграммы пробы из каждого флакона умно­жают на коэффициент С, рассчитанный предварительно.

Пример расчета. К₁ = К₂ = 20 · 10^-10; V₁ = V₂ = 0,5 см³; V₃ = 43 см³; t = 1 ч; n = 1; отдельные показатели Р₁ составляют 11,4; 11,5; 11,4; средний Р₁ — 11,4 см. Отсюда:

Флакон № 1: Р₂ = 16,2 см; А₁ = 16,2 • 168,2 = 2725 (нмоль С₂Н₄ /растение /ч).

Флакон № 2: Р₂ = 15,8 см; А₂ = 15,8 · 168,2 = 2658 (нмоль С₂Н₄/растение/ч) и т. д.

Если результаты хотят выразить в мкг фиксированного азота за 1 ч на 1 растение (мкг N/растение/ч), проводят пере­счет: количество этилена в нмоль С₂Н₄/растение/ч умножают на 0,0093 (28 / 3 • 10 ^-3), где 28 — молекулярная масса азота; 10 ^-3 — множитель для пересчета нмоль в мкг, так как 1 нмоль = 10 ^-9 моль, а 1 мкг = 10 ^-6 г; 3 — коэффициент (см. 12.4.2).

Дата добавления: 2014-01-04