Определение специфичности клубеньковых бактерий. Отбор активных (эффективных) культур клубеньковых бактерий

Материалы и оборудование

Стерильные чашки Петри, пинцет, нож, среда Фреда или бобовый агар, шпатели, корни бобового растения с клубеньками и фазе буто­низации — цветения, этиловый спирт, микроскопы и всё необходи­мое дли микроскопирования.

Вводные пояснения. Специфичность клубеньковых бактерий — это их избирательная способность заражать оп­ределенный род, вид, семейство бобовых растений или груп­пу родов. Критерием служит появление хотя бы одного клу­бенька на корнях растений, бактеризованных исследуемой культурой.

При отборе высокоэффективных клубеньковых бакте­рий основным, наиболее надежным критерием служит их влияние на урожай растений и содержание в них азота. Неко­торые клубеньковые бактерии образуют клубеньки, но при этом усвоения молекулярного азота в бобово-ризобиальном симбиозе не происходит или этот процесс идет очень слабо и потребность растений в азоте не удовлетворяется. Такие клу­беньки называют неактивными, или неэффективными. Обычно они мелкие, разбросаны по всему корню, содержат мало бактероидной ткани и быстро разрушаются. Бывают случаи, когда клубеньковые бактерии образуют клубеньки, паразитирующие на растении. Для получения высоких урожаев важно подобрать высокоэффективные культуры бактерий, изучить их особен­ности. Предварительный отбор можно проводить в условиях лабораторного, а затем вегетационного опытов. Окончательно же эффективность проверяют при полевых испытаниях.

Подбор активных культур клубеньковых бактерий по Разумовской. Его проводят в лабораторных или вегетацион­ных опытах. Для этого берут большие (180 x 40 мм) пробирки со средой следующего состава (г/л дистиллированной воды): К₂НРО₄ - 1,0; MgSO₄ - 1,0; СаСО₃ - 0,5; FeSO₄, H₃BO₃, MnSO₄ — следы, агар — 1,0. Среду разливают в пробирки слоем 4 см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин.

Одновременно проводят стерилизацию семян концентри­рованной серной кислотой по Nutman. Для этого мелкие семена погружают на 1—2 мин, а крупные — на 3—5 мин в серную кислоту, налитую в коническую колбу на 0,7—1,0 л. При этом колбу слегка покачивают. После обработки кислоту сливают и в колбу сразу же быстро вливают большую порцию стерильной водопроводной воды: если приливать воду медлен­но или в небольшом количестве, семена могут перегреться. Во­ду меняют несколько раз. По окончании промывки реакция среды на поверхности семян должна быть нейтральной (опре­деляют лакмусовой бумагой).

Стерильность семян проверяют посевом части их на МПА илибобовый агар. После прорастания семена переносят стерильнымпинцетом в пробирки с агаровой средой одновре­менно с 1 мл взвеси культуры клубеньковых бактерий.

Для затемнения корней пробирки снаружи обертывают плотной бумагой так, чтобы она закрывала слой агара и семе­на. Растения выращивают при естественном или искусствен­ном освещении. По мере их развития наблюдают за образова­нием клубеньков, массой растений и содержанием в них азота. Контролем служат пробирки без бактерий.

Общий азот в исследуемых растениях определяют микрометодом Кьельдаля. Для этого навеску хорошо измель­ченного воздушно-сухого растительного материала массой около 0,2 г помещают в колбу Кьельдаля на 50—100 мл, при­ливают 10 мл фенолсерной кислоты и ставят на сжигание. Че­рез сутки, когда жидкость приобретает желтую окраску, добав­ляют 1 каплю хлорной кислоты (если жидкость темно-бурая, то — 2). По окончании сжигания жидкость обесцвечивается.

Колбу охлаждают ипереносят раствор в мерную колбу на 100 мл, тщательно и многократно маленькими порциями опо­ласкивая колбу Кьельдаля дистиллированной водой и сливая промывные воды в ту же мерную колбу. Затем объем раствора доводят до метки и используют для дальнейшей отгонки.

Прибор Кьельдаля состоит из отгонной колбы Кьельдаля, обратного холодильника, отстойника и колбы — парообразова­теля. В парообразователь наливают дистиллированную воду (не менее ²/з объема), подкисленную концентрированной серной кислотой (1—2 мл) с несколькими каплями смешанного инди­катора Гроака.

Данный индикатор готовят следующим образом: к 100 мл 0,2%-ного спиртового раствора метилового красного добавля­ют 100 мл 0,1%-ного спиртового раствора метиленового сине­го. Хранят его в темной склянке с притертой пробкой длитель­ное время.

В течение всей работы вода в парообразователе должна быть окрашена в розовый цвет. В парообразователь вносят не­большое количество битого кирпича. Воду в парообразователе прогревают до начала работы. Для этого в отгонную колбу че­рез воронку наливают около 20 мл дистиллированной воды, воронку закрывают; зажигают под парообразователем горелку и доводят воду в нем до закипания. Зажим парообразователя при этом должен быть открытым, а зажим отстойника — за­крытым.

Под холодильником, на конец которого надета резиновая трубка с капельницей, ставят рабочий стакан (пустой или с во­дой). Затем осуществляют «холостой» отгон так, как описано ниже, используя вместо исследуемого раствора дистиллирован­ную воду.

Исследуемый раствор отгоняют следующим образом. Под капельницу холодильника ставят приемную колбу или стакан. В неё наливают 10 мл 2%-ного раствора борной кисло­ты, подкрашенной индикатором Гроака (на 1 л борной кисло­ты — 10 мл индикатора). Приемную колбу ставят на подставку так, чтобы капельница холодильника погрузилась в неё почти до дна.

В отгонную колбу пипеткой через воронку вносят 10 мл исследуемого раствора, ополаскивают воронку небольшими порциями дистиллированной воды, добавляют 10 мл 40%-ного раствора NaOH, снова ополаскивают воронку дистиллирован­ной водой, кран воронки закрывают и наливают в воронку дистиллированную воду.

Открывают зажим предварительно нагретого парообразо­вателя, впускают пар, придвигают горелку при закрытом зажи­ме отстойника.

При этом начинает выделяться аммиак, который образо­вался ранее при сжигании органического вещества навески и был затем связан фенолсерной кислотой. Он отгоняется в приемник, где поглощается борной кислотой с образованием бората аммония.

Отгон аммиака прекращают через 5 мин с момента изме­нения розовой окраски раствора приемной колбы на зелёную. После этого капельницу холодильника вынимают из раствора кислоты и отгоняют пар еще 1—2 мин. Тщательно обмывают капельницу дистиллированной водой и титруют содержимое колбы 0,01 н. раствором серной кислоты из микробюретки до перехода зеленой окраски титруемого раствора в слабо-розовую.

После каждого определения отставляют горелку, закры­вают зажим парообразователя, приемную колбу с отгоном за­меняют рабочим стаканом, открывают зажим отстойники для слива раствора из отгонной колбы; когда в отстойнике остает­ся примерно 1/3 жидкости, зажим отстойника закрывают. При­бор снова готов к определению.

Расчет количества азота (N) (%) проводят по формуле

где а₁ — количество 0,01 н. H₂SO₄, пошедшем на титрование «холосто­го» раствора, мл; а₂ — количество 0,01 н. H₂SO₄, пошедшей на титрова­ние испытуемого раствора, мл; 0,00014 — количество азота, связанное 1 мл 0,01 н. раствора H₂SO₄, г; 100 — пересчет в %; V — объем исход­ного раствора, мл; b — аликвота, взятая для отгона, мл; Н — навеска, г.

Определение азотфиксации изотопным методом. Более точные данные о размерах азотфиксации бобово-ризобиального симбиоза можно получить, выращивая растения, инокулированные клубеньковыми бактериями, в атмосфере, содер­жащей меченый азот — ^I5N, с последующим определением количества фиксированного азота в масс-спектрометре.

Инокулированные растения выращивают длительное время в изолированной камере в газовой среде, содержащей меченый ^I5N. При этом регулируют газовый режим, контроли­руют изотопный состав азота в газовой смеси и поддерживают определенную влажность.

По обогащению азота газовой смеси камеры, растений и субстрата изотопом ¹⁵N рассчитывают количество азота, ис­пользуемого тест - растением из воздуха, мг:

где х — количество азота, усвоенного из воздуха, мг; а — обогащение азота газовой смеси изотопом ^I5N, ат% ^I5N₂; а₁ — обогащение азота ис­следуемого образца изотопом ¹⁵N, ат% ^I5N₂; b — содержание азота в образце, мг; 0,386 — обогащение изотопом ^I5N образца в естествен­ном состоянии.

Определение азотфиксирующей активности бобово-ризобиального симбиоза ацетиленовым методом по Парийской и Гореловой. Для этого растения выращивают в пробирках (2x20 — 2x30 см) с отростком, на который надевают тонкий резиновый шланг, герметично закрытый на конце стеклянной пилочкой. Пробирки на 1/4 заполняют средой следующего со­става (г/л дистиллированной воды): КС1 — 0,74; КН₂РО₄ — 0,3; К₂НРО₄ - 0,3; MgSO₄·7H₂O - 0,5; CaSO₄ - 0,5; FeCl₂ - 0,04; агар - 8.

Клубеньковые бактерии вносят в теплую среду в кон­центрации 1 • 10⁷ клеток/мл. Проросшие семена, предваритель­но простерилизованные (см. выше), помещают по одному в пробирки на поверхность застывшей, засеянной ризобиями среды. Растения выращивают в оранжерее в течение месяца. Азотфиксирующую активность определяют после 16-часового светового дня, вводя в пробирки по 0,5 мл ацетилена (см. 12.4.2).

Дата добавления: 2014-01-04