Экспресс-метод определения жизнеспособности клеток клубеньковых бактерий в сухом нитрагине по Шильниковой, Сигуте

Определение жизнеспособности клеток клубеньковых бактерий

Основной метод. 1 г сухого нитрагина разводят в 99 мл стерильной водопроводной воды. Быстрорастущие культуры выдерживают на качалке 90 мин, медленнорастущие — 120 мин (220 об/мин, 28 °С). Определяют рабочую концентрацию клеток (10—30 млн. в 1 мл). Затем суспензию исследуе­мых клеток помещают в две одинаковые пробирки и окраши­вают: в одной пробирке — примулином (разведение 1: 1000), в другой — акридиновым оранжевым (разведение 1: 200 000).

Через 15 мин окрашенные суспензии наносят на пред­метные стекла по 0,01 мл, еще через 3—5 мин суспензию на­крывают покровным стеклом 18x18 мм, края препарата пара­финируют и подсчитывают клетки (не менее 100 полей зрения в трех повторностях для каждого образца).

Сначала просматривают препарат, окрашенный акриди­новым оранжевым, с масляной иммерсией под микроскопом МЛ-2. Площадь покадровой рамки (0,00306 мм²) является пло­щадью поля зрения. Количество полей зрения в площади 18x18 мм равно 105 882. Зная среднее количество бактерий в 1 поле зрения и разведение, подсчитывают общее количество бактерий в мазке.

Препараты, окрашенные акридиновым оранжевым, мо­гут храниться 3—5 месяцев. На этих препаратах учитываются и живые, и мертвые клетки (общее количество). Соотношение живых поврежденных и мертвых клеток считают на препара­тах, окрашенных примулином — люминесцентным красителем, импрегнирующим оболочки живых клеток только в незначи­тельной степени, легко проникающим в мертвые клетки и на­капливающимся в них. Благодаря этой способности красителя живые клетки тускло люминесцируют, мертвые — светятся ярким зеленовато-желтым цветом. Просматривают препараты, окрашенные примулином, в свете люминесценции (при осве­щении объекта сверху, через объектив).

Можно исключить окраску клеток акридиновым оранже­вым. В этом случае после просмотра препарата, окрашенного примулином, в свете люминесценции следует просмотреть то же поле зрения при фазово-контрастном освещении объекта снизу, через конденсор. Надо помнить, что при освещении препарата снизу он быстро выгорает. Продолжительность анализа — не более 4 ч.

Число живых (жизнеспособных) клеток (В) определяют по формуле

В = А - M,

где А — общее число клеток в препарате, подсчитанное при окраске акридиновым оранжевым в светлопольном микроскопе или при окра­ске примулином в фазово-контрастном микроскопе; М — число поврежденных и мертвых клеток.

Метод с использованием контрастных флуорохромов. Ис­пользуют контрастные флуорохромы — аурамин 00 и конго красный. Начальные этапы подготовки те же, что и в первом опыте. После реактивации клеток и выдерживания на качалке их суспензию вносят в мерные центрифужные пробирки и окрашивают 3 мин конго красным (разведение 1: 2000) при рН 9,0, затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Потом заменяют конго красный аурамином (разведение 1: 20 000) и при рН 4,4 выдерживают 10 мин. 0,01 мл окрашенной суспен­зии наносят на предметное стекло, через 3—5 мин накрывают покровным стеклом (18x18 мм), края препарата парафинируют.

Препарат просматривают в люминесцентном микроскопе не более 30 мин в сине-фиолетовом свете. Исследуют не менее 100 полей зрения в трех повторностях для каждого образца. Живые клетки светятся зеленым цветом, мертвые — красным. Продолжительность анализа — не более 4 ч.

Важное условие анализа — подготовка покровных и пред­метных стекол. Их кипятят 20 мин в растворе нейтрального мыла («детское») на дистиллированной воде; тщательно про­мывают проточной и споласкивают дистиллированной водой; подсушивают и заливают хромовой смесью не менее чем на 2 ч. В этой же смеси стекла можно хранить.

После обработки хромовой смесью стекла промывают проточной водой, затем — дистиллированной и кипятят 5 мин в 5%-ном растворе Na₂CO₃; снова споласкивают дистиллиро­ванной водой, потом — слабым раствором уксусной кислоты и тщательно промывают дистиллированной водой; сушат на воздухе или в сушильном шкафу. Стекла хранят в смеси Ники­форова (спирт: эфир = 1: 1), но лучше их использовать сразу. Указанная подготовка исключает свечение фона самих стекол при обработке препарата люминофором.

Дата добавления: 2014-01-04