Определение коли - титра и коли - индекса

Кишечная палочка — самый многочисленный и постоянный обитатель толстого отдела кишечника человека и всех тепло­кровных животных. Она выделяется во внешнюю среду с фекальными массами, поэтому используется как индикатор фекального загрязнения внешней среды и косвенный показа­тель наличия в воде болезнетворных микробов — возбудителей кишечных инфекций человека, выделяемых с фекалиями в во­ду и другие объекты.

Таким образом, кишечная палочка служит санитарно-показательным микроорганизмом воды. Поскольку она не образует спор и гибнет при относительно щадящих методах обеззаражи­вания, её присутствие в консервированных продуктах или воде указывает на нарушение режима консервирования и на недо­статочность обработки воды, так как если кишечная палочка сохранила жизнеспособность, значит, могли выжить и другие неспорообразующие бактерии, такие, как дизентерийная шигелла, брюшнотифозная сальмонелла и другие патогенные бактерии — возбудители желудочно-кишечных заболеваний.

Коли-индекс (индекс кишечной палочки) — это число ки­шечных палочек, обнаруженных и 1 л исследуемой воды (по международным стандартам — в 100 мл).

По существующим нормативам коли-титр питьевой воды не должен быть менее 333 мл (в Москве — не менее 500 мл), а коли-индекс — не более 3 (см. 15.1.4.).

Коли-титр определяют методами бродильных проб. Дан­ные методы основаны на способности кишечной палочки теп­локровных животных и человека развиваться при повышенных температурах (43—44 °С) и сбраживать сахара (маннит, глюко­зу и др.) с выделением газа. Существуют двух- и трехэтапные бродильные методы.

Трехэтапный бродильный метод заключается в следую­щем. На первом этапе ставят первую бродильную пробу: различные разведения исследуемой воды при помощи стериль­ных пипеток вносят в колбы и пробирки со специальными уг­леводными жидкими средами (среда Булира, среда Эйкмана, розоловая и др.) и поплавками.

В зависимости от предполагаемого микробного загрязне­ния водоисточника применяют разные схемы посева. Так, при исследовании водопроводной воды делают посевы в общем объеме 300 мл (2 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл). При исследовании воды открытых водоемов (речной, озерной и т. д.) не­обходимо посеять воду в общем объеме 111,1 мл (1 объем — 100 мл; 1 объем — 10 мл и по одному объему в 1 мл и 0,1 мл). Соотношение между средой и засеваемой водой должно быть 1: 2. Поэтому посевы малых количеств воды (1 мл, 0,1 мл) выполняют в пробирки с разведенной средой (обычной концентрации), а большие объемы воды (100 мл и 10 мл) — в концентрированную среду.

Посевы выращивают в термостате при 43—44 °С в тече­ние 24 ч. При указанной температуре подавляется развитие микроорганизмов, не имеющих санитарно-показательного зна­чения для воды. Затем просматривают посевы для выявления признаков роста кишечной палочки (наличие пузырьков газа в поплавках, изменение цвета, помутнение).

На втором этапе для подтверждения правильности обнаружения роста кишечной палочки в жидкой среде из посе­ва с признаками роста при помощи бактериальной петли дела­ют высев в чашки Петри со средой Эндо и выращивают куль­туру при 37 °С 24 ч.

Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и обесцвеченного индикатора (фуксин обесцвечен сульфитом натрия). На данной среде бактерии группы кишечной палочки теплокровных жи­вотных образуют типичные темно-красные, ярко-красные или розовые колонии с темным центром, имеющие металлический блеск или без него. Столь характерный рост на среде Эндо этих бактерий обусловлен тем, что они активно сбраживают лактозу, продукты расщепления которой вызывают восстановление ин­дикатора фуксина, окрашивающего колонии. При отсутствии характерного роста на пробу дают отрицательный ответ.

При наличии типичных колоний из них делают мазки, которые окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках обнаруживают мелкие неспорообразующие грамотрицательные палочки, то переходят к третьему этапу для оконча­тельного подтверждения результатов исследования.

На третьем этапе из типичных колоний, в которых при микроскопировании обнаружены характерные микробные клетки, делают пересев в разведенную жидкую углеводную сре­ду (Булира, Эйкмана и др.). Посевы выращивают при 43— 44 °С в течение 24 ч, после чего учитывают окончательно. При наличии в посевах помутнения, газообразования и изменения цвета дают положительный ответ, результаты которого выражают в виде коли-титра. При отсутствии газообразования даёт­ся отрицательный ответ, т. е. данные первой бродильной пробы подтверждаются.

Коли-индекс определяют методом мембранных фильтров. Для этой цели используют мембранные фильтры № 3 (ультра­фильтры) — пористые пленки, изготовленные из микроклет­чатки (нитроцеллюлозы), с диаметром пор 0,7 мкм. Перед фильтрацией их подвергают стерилизации двойным кипячени­ем в дистиллированной воде в течение 15—20 мин. Затем сте­рильным пинцетом фильтры помешают на предварительно профламбированную поверхность фильтровального прибора Зейтца. Через фильтр Зейтца проводят фильтрацию под ваку­умом определенного количества исследуемой воды (через один мембранный фильтр — не более 100 мл воды).

По окончании фильтрации освобождают фильтроваль­ную пластинку, частично разбирая прибор. При помощи сте­рильного пинцета фильтр кладут осадком вверх на поверхность среды Эндо, залитой в чашку Петри, плотно прижимая к сре­де. В одну чашку можно поместить 4—5 фильтров. После куль­тивирования в термостате при 37 °С в течение 18—24 ч подсчи­тывают выросшие на фильтре колонии, характерные для груп­пы кишечной палочки. Из 2—3 колоний, типично окрашенных и бесцветных, берут материал для мазков, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Если в мазках присутствуют мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, из оставшейся части колонии де­лают пересев в пробирки с небольшим объемом жидкой угле­водной среды (среда Булира или др.). Посевы выращивают при 43—44 °С в течение 24 ч. Наличие газообразования — последний показатель присутствия бактерий группы кишечной палочки.

Дата добавления: 2014-01-04