Определение изоэлектрической точки казеина

Открытие в гидролизате фосфорной кислоты.

Открытие в гидролизате казеина белкового компонента.

Фосфопротеины.

Осаждение белков органическими кислотами.

Реакции с трихлоруксусной и сульфосалициловой (2-гидрокси-5-сульфобензойной) кислотами являются специфическими и чувствительными. Их используют в клинических лабораториях при обнаружении белка в моче и других биологических жидкостях. Сульфосалициловая кислота способна осаждать продукты распада белков - пептиды. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки. Ее используют при определении небелкового (остаточного) азота крови, в состав которого входят продукты распада и обмена белков.

В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В одну пробирку добавляют 1-2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую - трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

Контрольные вопросы

1. Как можно разделить смесь аминокислот в гидролизате белка?

2. Какие цветные реакции на белки знакомы Вам из курса биоорганической химии?

3. Какая аминокислота, содержащаяся в белках, обнаруживается реакцией Миллона? Приведите ее формулу.

4. Какая аминокислота, содержащаяся в белках, обнаруживается реакциями Адамкевича и Шульце - Распайля? Приведите ее формулу.

5. Чем обусловлено осаждение белков при действии солей тяжелых металлов?

6. Что понимают под денатурацией белка?

7. Какое практическое применение находят реакции осаждения белков органическими кислотами?

8. Почему в клинической практике для осаждения белков используют азотную, а не серную или соляную кислоты?

Работа 2. Сложные белки – фосфопротеины и гликопротеины

Типичным представителем фосфопротеинов является казеин молока. При щелочном гидролизе казеин распадается на белок и фосфорную кислоту.

К 0,5 мл гидролизата казеина прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сульфата меди до появления сине-фиолетового окрашивания. Положительная биуретовая реакция доказывает белковую природу казеина.

1 мл гидролизата нейтрализуют 25% азотной кислотой (контроль по индикаторной бумаге) и добавляют 0,5 мл раствора молибдата аммония в азотной кислоте. Через 5 минут осадок белка и продуктов неполного гидролиза белков отфильтровывают. К фильтрату добавляют 0,5 мл 2% раствора гидрохинона и оставляют на 5 минут. Затем добавляют по каплям добавляют 1 мл раствора карбонат-сульфита натрия. Появляется синее окрашивание раствора, обусловленное образованием молибденовой сини.

В пять пробирок приливают из бюретки следующие количества 0,1 н. раствора уксусной кислоты: в первую —0,25 мл; во вторую — 0,5 мл; в третью — 1,0 мл; в четвертую — 2,0 мл и в пятую — 4,0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8,75 мл, 8,5 мл, 8,0 мл, 7,0 мл и 5,0 мл воды. После добавления 0,1% раствора казеина в ацетате натрия значения рН в полученных смесях будут равны 5,3; 5,0; 4,7; 4,4 и 4,1 соответственно.

В каждую из пробирок приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают за степенью помутнения раствора в них. Там, где помутнение максимально, рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка (рН 4,7).

Дата добавления: 2014-01-05