Опыт 2. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче

Опыт 1. Количественное определение активности амилазы в сыворотке крови.

Работа 8. Обмен углеводов

Моча и сыворотка крови здоровых людей обладают низкой амилазной активностью по сравнению с амилазой слюны. Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используется в клинической практике при диагностике заболеваний поджелудочной железы. При остром панкреатите активность фермента в крови и в моче увеличивается в 10-30 раз, при хроническом панкреатите, раке поджелудочной железы, приступе желчнокаменной болезни – в 3-5 раз. При нарушении функции почек, а также при некоторых заболеваниях крови повышенная активность фермента в крови не сопровождается увеличением его активности в моче.

Фермент амилаза катализирует гидролиз α-1,4-гликозидной связи крахмала и гликогена. Метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмала до и после ферментативного гидролиза по окрашиванию в реакции с реактивом Люголя. Работу проводят согласно таблице 2:

Таблица 2. Определение активности амилазы.

Реактивы	Количество реактива, мл
опыт	контроль
Раствор крахмала	1,0	1,0
Сыворотка крови	0,02	-
	Инкубировать при 37^0 5 минут
Реактив Люголя	1,0	1,0
Дистиллированная вода	8,0	8,0
Сыворотка крови	-	0,02

Оба раствора фотометрируют на фотоэлектроколориметре при 630 нм (толщина кюветы 10 мм) относительно воды. Расчет активности амилазы проводят по формуле:

((D_к – D_оп)/D_к)×200,

где D_к – оптическая плотность контрольной пробы, D_оп – опытной пробы.

Пировиноградная кислота (ПВК) является одним из промежуточных продуктов обмена углеводов. В анаэробных условиях (при гипоксии) она восстанавливается в молочную кислоту, а в аэробных – подвергается окислительному декарбоксилированию и превращается в ацетил-КоА. ПВК – один из основных источников глюконеогенеза. Вследствие большой скорости реакции превращения пировиноградная кислота присутствует в тканях и биологических жидкостях в небольшом количестве. В крови ее содержание составляет 0,5-1 мг /100 мл пирувата. Содержание пирувата в моче в норме составляет 2 мг /100 мл, суточное выведение его с мочой - 10-25 мг.

Наиболее резкое увеличение концентрации пирувата (ПВК) в крови и, как следствие, в моче, отмечается при мышечной работе и В₁- витаминной недостаточности. Это явление отмечается также при заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной декомпенсации, токсикозе и др.

Принцип метода: пируват с 2,4-динитрофенилгидразином образует окрашенное соединение - 2,4-динитрофенилгидразонпируват. Его экстрагируют из реакционной смеси толуолом. При добавлении спиртового раствора щелочи развивается красно-оранжевое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна количеству ПВК.

Ход работы: к 1,0 мл мочи прилить 0,5 мл 0,1% 2,4-динитрофенилгидразина, перемешать и через 5 минут добавить 2,5 мл насыщенного водой толуола. После встряхивания в течение 1 мин оставить раствор до расслоения воды и толуола. Из верхнего толуолового слоя отобрать пробу объемом 1 мл сухой градуированной пипеткой и перенести в сухую пробирку, добавить 3 мл спиртового раствора КОН. Пробу с 1 мл стандартного раствора пирувата обрабатывают так же, как опытную. В контроле на реактивы моча замещается 1 мл воды. Через 10 мин пробы фотометрировать против контроля на реактивы при длине волны 400-415 нм на фотоэлектроколориметре.

Расчет проводится по формуле: Х=(D_о*50мг)/D_с, где: D_о – оптическая плотность опытного раствора, D_с – оптическая плотность стандартного раствора, 50 мг - концентрация стандарта пировиноградной кислоты, Х - концентрация пирувата в моче.

Дата добавления: 2014-01-05