Некаталитические методы

Некаталитические методы не отличаются высокой чувствительностью, но они селективны, позволяют определять в смеси близкие по свойствам вещества без их предварительного разделения. Например, два сходных по химическим свой­ствам соединения А и В реагируют с одним и тем же реагентом R, образуя про­дукты Р₁, и Р₂, но реакция с участием вещества А идет гораздо быстрее, имеет гораздо большую константу скорости (к₁ > к₂). Для того чтобы определить один из компонентов смеси с достаточной точностью, необходимо относительно боль­шое различие в константах скорости реакций этих компонентов с одним и тем же реагентом. Добиться этого можно, изменяя pH или температуру системы, под­бирая соответствующие растворители и т.д. Если к₁/к₂> 500, то в начальный пе­риод реакции можно определять вещество А на фоне вещества В с погрешностью менее 1 %. Если же константы скоростей реакций реагента с близкими по свой­ствам компонентами смеси мало отличаются друг от друга, что не позволяет пре­небречь какой-либо из реакций, используют специальные расчетные методы. Так, еще в 1930 г. в США был предложен остроумный и достаточно точный способ раздельного определения изомеров бутена, основанный на различной скорости взаимодействия продуктов их бромирования с иодидом калия. Некаталитические кинетические методы применяют для анализа смесей органических соединений (спиртов, сахаров, аминов), а также для анализа смесей близких по свойствам ионов металлов (щелочноземельных или редкоземельных элементов).

Каталитические методы

Каталитические методы анализа (в отличие от некаталитических) характе­ризуются высокой чувствительностью. Представим кинетическое уравнение ка­талитической реакции в следующем виде:

и преобразуем его в выражение

Из уравнения видно, что снизить С_кат можно следующими способами:

· обеспечить снижение Δх; чтобы регистрировать очень малые изменения кон­центрации индикаторного вещества, нужно использовать наиболее чувствитель­ные способы измерения концентрации;

· увеличить время Δt наблюдения за протеканием индикаторной реакции;

· использовать оптимальные (как правило, высокие) концентрации реагентов А и В.

Наиболее эффективным приемом повышения чувствительности каталитиче­ских методов является увеличение константы скорости k каталитической реакции за счет введения активаторов, оптимизации pH раствора, повышения температуры, проведения процесса в водно-органических средах.

Реальную чувствительность каталитических методов ограничивает протекание
(наряду с каталитической) некаталитической реакции, обусловленной наличием различных примесей в реактивах и воде или другом растворителе. Все это создает «фон», колебания которого ограничивают предел обнаружения катализатора. Уменьшить влияние фона можно, используя реактивы и растворители высокой степени чистоты.

Варьируя условия проведения реакции (концентрации реагентов, pH, природу растворителя), используя активаторы и маскирующие вещества, можно добиться того, что катализатором в индикаторной реакции будет только одно соединение — определяемый компонент. Однако обеспечить это удается не всегда. Каталитические методы используют для определения микроколичеств металлов, прежде всего первого переходного ряда и группы платиновых металлов, а также для определения некоторых анионов (I^-, С1^-, Вг^-, S^2-). Органические вещества, особенно токсичные и лекарственные препараты, определяют как по их собственному каталитическому действию в индикаторных реакциях, так и по их ингибирующему или активирующему действию на ион металла-катализатора. Кинетические методы используют в анализе биологических объектов и объектов окружающей среды, в клиническом анализе, а в некоторых случаях — и в заводских лабораториях.

Биохимические методы анализа

Ферментативные методы. Среди каталитических методов наиболее высокой чувствительностью и селективностью обладают ферментативные методы, ос­нованные на использовании реакций, катализируемых ферментами — биологи­ческими катализаторами, ускоряющими химические процессы в живых организ­мах и вне их. Эти методы стали применять в аналитических лабораториях в 1970-е гг. С их помощью можно определять сами ферменты, субстраты — со­единения, превращения которых катализируют ферменты, а также эффекторы (активаторы или ингибиторы) — соединения, воздействующие на каталитичес­кую активность ферментов.

Ферменты обладают уникальными свойствами, которые отличают их от дру­ гих катализаторов:

· Прежде всего, это — необычайно высокая каталитическая ак­тивность. Добавка незначительного количества (10 ^-9— 10 ^-7 моль/л) фермента иногда ускоряет превращение субстрата в 10⁸—10¹² раз.

· Другое важное свойство — специфичность действия фермента в отношении структуры субстрата, типа ин­дикаторной реакции и условий ее проведения. Специфичность фермента — это прежде всего его способность ускорять превращение только одного типа субстра­тов (например, одноатомных спиртов), а иногда — только какого-либо одного субстрата. Так, фермент уреаза катализирует только гидролиз мочевины. Вместе с тем эффективно влияет на скорость этой индикаторной реакции только уреа­за. Специфичность взаимодействия в паре фермент — субстрат, неоднократно сопоставляемая со специфичностью пары ключ —замок, обусловлена сложной структурой и весьма сложным механизмом действия фермента.

Ферменты — сложные белковые молекулы, представляющие собой высокомо­лекулярные соединения, состоящие из a-L-аминокислот. связанных друг с дру­гом пептидными (амидными) связями. Белковая часть фермента (апофермент) может быть связана с небелковыми компонентами (кофакторами); такой комп­лекс называют холоферментом. Основной частью фермента, определяющей его каталитические свойства, является активный центр — участок белковой молеку­лы, на котором происходит превращение субстрата (рис.). Иногда в актив­ном центре фермента выделяют участок, связывающий субстрат, и каталитичес­кий участок, содержащий каталитически активные группы белка (кофакторы). Часто эти участки совпадают. Как правило, активный центр находится в углуб­лении («кармане») белковой глобулы, размерам и форме которого должна соот­ветствовать молекула субстрата. Для многих ферментов характерно наличие ре­гуляторных участков, которые взаимодействуют с веществами, влияющими на ак­тивность фермента, т. е. активаторами или ингибиторами.

Ингибитор

Активатор

Механизм действия ферментов включает сорбцию субстрата на активном цен­тре фермента и образование активного комплекса (фермент — субстрат) в резуль­тате гидрофобных, полярных и ионных взаимодействий. В этом комплексе про­исходит сближение и ориентация реагирующих групп фермента и субстрата. Взаи­модействие между ферментом и сорбированным субстратом носит полифункциональный характер, при котором молекула субстрата подвергается атаке сразу не­скольких каталитических групп активного центра фермента, что и обусловлива­ет его высокую каталитическую активность.

Скорость реакций с участием ферментов можно измерять разными способа­ми. Чаще всего применяют фотометрические методы. При этом в качестве инди­каторных используют катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (фер­ментами, катализирующими окислительно-восстановительные реакции), а также гидролазами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окра­шенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы контроля ферментативных реакций. Контролировать скорость биохимических реакций, протекающих с поглощением или выделени­ем протонов, а также окислительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода или обрзованием пероксида водорода, удобно электрохимическими методами (потенциометрия, амперометрия и т.д.)

Ферментативные методы находят широкое применение в анализе самых разнообразных объектов — медицинских (биологических жидкостей, тканей живых организмов), пищевых продуктов, фармацевтических препаратов; для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов в производстве. Эти методы используют и для определения токсичных органических и неорганических соединений в объектах окружающей среды, особенно в природных водах.

Иммунохимические методы. К биохимическим методам кроме ферментативных относят также иммунохимические методы. Напомним, что генетически чужеродные вещества, попадая в организм высших животных и человека, способны вызывать ряд специфических процессов, направленных на удаление этих веществ из организма. Система, регулирующая эти специфические процессы, называется иммунной, а сами процессы — иммунологическими. Вещества, способные вызывать специфические иммунологические реакции в организме, в том те биосинтез специфических антител, называют антигенами. К антигенам относятся, в частности, белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты. Важнейший иммунологический процесс – образование сецифических белков крови –антител (иммуноглобулинов). Биологическая функция антител состоит в защите организма от чужеродных веществ (антигенов) путем их распознавания, специфического связывания в прочные иммунные комплексы и удаления их из организма. Таким образом иммунохимические методы анализа основаны на специфическом связывании определяемого соединения – антигена соответствующими антителами. Иммунохимическая реакция представлят собой сложный процесс, протекающий в несколько стадий. Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании осадка при взаимодействии антител с антигенами. За протеканием этого процесса обычно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественноопределяют относительно высокие концентрации компонентов. Эти методы длительны и трудоемки.

Дата добавления: 2014-01-06