Методи одержання продуцентів вітамінів

Інші амінокислоти.

Основні продуценти: Corynebacterium, Brevibacterium. Крім того глютамін отримують культивуванням Flavobacterium ringense. Аланін – р. Pseudomonas. Для виробництва лейцину крім Brevibacterium flavum використовують Br.lactofermentum. Проводяться дослідження щодо створення плаз мідних надпродуцентів Serratia marcescens. Конструюють плазміди і одночасно вносять декілька видів плазмід.

Отримують в промислових масштабах вітаміни:

1. Екстрагують з природної сировини (А, Е)

2. Хімічним синтезом (А, К, В1)

3. Ферментація (В12, В6, В2, β-каротин)

4. Комбінований синтез (хімічні + мікробіологічні стадії)

1. Вітаміни групи В синтезуються дріжджами р. Saccharomyces, Candida, грибами Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, бактеріями р. Agrobacterium, актиноміцетами, водоростями.

· Рибофлавін (В2). Продуцент всі вищезазначені групи м/о. Найбільш досліджені і застосовуються: гриб Eremotherium ashbyii, мутанти Saccharomyces cerevisiae. Властивість до суперпродукування В2 у Eremotherium ashbyii нестійка. Вбудовування проводиться шляхом ампліфікації генів рибофлавінового оперону. Крім того проводиться мутагенез в напрямку мутацій, що порушують регуляторні механізми і відключають пригнічення синтезу рибофлавіну. Отримані трансформанти B.subtilis, здатний за 25 – 35 годин виділяти 2,5 – 4,5 г/л рибофлавіну. Особливість культивування: в середовищі обов’язково повинна бути меляса, що містить речовини, що є попередниками В2.

Хімічний синтез з диметиланіліну та рибози. Рибозу отримують мікробіологічним шляхом.

ЛК_7 (15.10)

Кобаламіни

Кобаламіни (В₁₂) отримують методом хімічного синтезу, але він вимагає проведення 37 послідовних стадій, тому в промисловості використовують тільки б/т метод.

Основні продуценти – штами, що належать до роду Propionibacterium. З природних отримують штами, що дають від 1 до 8,5 мг/л В₁₂. За допомогою мутагенезу був отрианий P.shermanii, який давав 58 мг/л.

З P.technicum був виділений ген, який вбудовували в плазміду рВR322 і далі плазміду вносили в E.coli.

Крім пропіоновокислих бактерій, використовують Psevdomones. Наприклад, з виділеного із навколишнього середовища Psevdomones denitrificans, за допомогою селекції і мутагенезу отримують промисловий штам. Використовують також гени, виділені з Bacillus megaterium. З нього виділяють 11 генів, що беруть участь у синтезі В₁₂.

Вітамін А (каратиноїди)

Продуцентами є дріжджі, міцеліальні гриби та одноклітинні зелені водорості. Застосовують селекцію і рідко мутагенез. Генетичну маніпуляцію не здійснюють.

Вітамін С

Технологія отримання L-аспаргінової кислоти включає 5 етапів:

1) каталітичне відновлення D-глюкози в D-сорбітол;

2) м/б перетворення D-сорбітолу в L-сорбозу, для цього використовують сорбітолдегідрогеназу, що отримують з Acetobacter suboxydans;

3) хімічне окислення L-сорбози в 2-кето-L-гулонову кислоту (2-КLG);

4) хімічне перетворення 2-КLG в єнольну форму з одночасним утворенням натрієвої солі;

5) 2-КLGNa+кислота= L-аскорбінова кислота.

Було визначено, що 2-КLG можна отримати м/б способом без застосування хімічного синтезу, при цьому одна група бактерій- Acetobacter, Gluconobacter, перетворює глюкозу в 2,5-дикето-D-глюконову кислоту, а інші м/о, наприклад корінебактерії, бревібактерії, артробактерії, синтезують фермент 2,5-DKG-(дикетоглюконова кислота) редуктазу, що перетворює 2,5-DKG в 2-КLG. Основна проблема – різні вимоги до культивування, тому з корінебактерії виділили ген 2,5-DKG-редуктази, секвенували його, замінили систему початкової транскрипції, трансляції і отриману конструкцію ввели в E.coli. В результаті налагодився хороший синтез 2,5-DKG-редуктази. Далі провели ще одне клонування з E.coli в Erwinia herbicola, отримана культура здійснювала перетворення глюкози в 2,5-DKG в переплазматичному просторі, а потім 2,5-DKG перетворювалась в 2-КLG за допомогою чужерідного фермента уже в цитоплазмі.

Далі застосовувався мутагенез, при якому було замінено глутамін на аргінін в 2,5-DKG-редуктазі в одному положенні, гліцинові залишки на аланінові в двох тположеннях. В результаті отримали більш термостабільну форму ферменту.

Біосинтез антибіотиків

З 1920 року почалось виробництво антибіотиків. На даний час відомо більше 10 тисяч речовин з антибіотичною дією. Тільки невелика кількість використовується в якості ЛЗ, що пов’язано з токсичністю, широким спектром дії.

Найбільш часто антибіотики, які є ЛЗ, виробляються з стрептоміцетів. Перші продуценти – актиноміцети або стрептоміцети. Одна з особливостей – міцеліальний ріст, тому у випадку трансформації спочатку руйнують клітинну стінку (найчастіше ПЕГ) і отримують окремі протопласти, а потім проводять трансформацію. Після цього висівають на середовище в умови відновлення клітинної стінки, а потім пересівають на середовище для відбору трансформантів.

Біосинтез 1 антибіотику стрептоміцетом – це 10-30 ферментних реакцій, тому клонування генів – складний процес. Клонування генів біосинтезу даного антибіотика відбувається спочатку за допомогою мутагенезу (отримують та відбирають мутантів, що втратили здатність до синтезу антибіотика), далі поводять трансформацію цих мутантів ДНК, яка отримана

з білка клонів дикого типу, що здатні до біосинтезу, потім відбирають трансформанти, здатні др синтезу антибіотика (ця здатність була відновлена за рахунок комплементарної ДНК). Найчастіше в якості комплементарної виступає плазмідна ДНК. Таку трансформацію і дослідження застосовують тільки у випадку, коли всі гени синтезу антибіотика знаходяться разом.

Робота з стрептоміцетами спрямована не тільки на збільшення продуктивності, але й на створення антибіотиків. Наприклад, відома плазміда, що несе послідовність ДНК, яка має всі гени біосинтезу антибіотика актинородини з ацетату. Вона наявна в Streptomyces colelicolor. Таку плазміду або її частини з відповідними генами вводили в інший штам A.suboxydans i S.violaceoruber – подуценти мідерміцину або гранатицину та дигідрогранатицину. Всі ці антибіотики є індикаторами кислотності (при різних рН різний колір, що сприяє легкому відбору трансформуючих штамів. Таким чином, були отримані штами S.violaceoruber, які несли плазміду і синтезували новий антибіотик – дигідрограгранатиродин і медерродин. Структурно, як вихідні антибіотики, так і нові, дуже схожі і їх можна вважати належними до 1 групи.

Ще один приклад: отримання полікетидних антибіотиків. Основні продуценти – актиноміцети. Синтезуються також грибами та рослинами, але не мають промислового значення. Існують 2 класи ферментів, що відповідають за їх синтез:

1) синтази, що каталізують біосинтез ароматичних полікетидів;

2) синтази, що здійснюють конденсацію ароматичних полікетидів (реакцію полімеризації).

Генноінженерними методами було визначено гени цих ферментів, а потім були проведені різні модифікації цих генів, наприклад, видалення ДНК, що кодує β-кеторедуктазу, що пригнічує синтез полікетидних антибіотиків. Така делеція призводила до накопичення промислового продукту і піддією інших ферментів та мутагенезу утворювався інший полікетидний антибіотик – еритроміцин.

Проводять експерименти стосовно визначення, які гени відповідають за кожен з ферментів, з метою спрямованого отримання певних хімічних структур нового антибіотика. Вважають, що 1 антибіотик кодується трьома і більше генами (мінімальна кількість – полікетидсинтаза, тому оновні модифікації здійснюють з нею).

ЛК_8 (22.10)

Продуценти: гриби р. Penicilium, Aspergilus (P. Chrysogemun, P. notatum).

Вміст пеніциліну в культуральній рідині 50·10³ од/мл.

До пеніциліну сформулювалась велика кількість стійких штамів. Ця стійкість обумовлена плазмідами, найбільш поширеним є механізм розщеплення пеніциліну β -лактазами. Тому створюють напівсинтетичні похідні пеніциліну, застосовують лікарські препарати, що містять додаткову клауланову кислоту, що є інгібіторами β -лактаз.

Клаулонова кислота схожа структурно з пеніциліном (β -лактан) і більше споріднена до β -лактаз. Продуцент Streptim. clavuligeru s.

Основа для виробництва напівсинтетичних пеніцилінів - природні пеніциліни без модифікації.

Напівсинтетичний пеніцилін мікробіологічними методами:

· Біосинтез пеніциліну за допомогою мічених сполук;

· Без допомоги хімічних сполук, продуценти отримуються в результаті генних мутацій;

· Стимулювання біосинтезу антибіотиків в присутності активатора (натрієва сіль полі-2,5-дигідроксифенилен-4-тіосульфокислоти). Штами отримують селекцією та мутагенезом. Генетичні модифікації спрямовані на збільшення ступеня активації

· Біотехнологічне отримання пеніциліну та хімічна модифікація.

Підвищення ефективності синтезу антибіотиків грибами і Streptomices:

1. Збільшення копійності генів;

2. Вбудовування сильних промоторів, частіше бактерійних;

3. Покращення біосинтетичних властивостей за рахунок впливу на лімітуючі фактори.

Продуценти актиноміцети - лімітуючим є кількість О₂, що доступний для клітини. Для вирішення цієї проблеми було виділено ген, що кодує гемоглобін подібний переносник О₂. Ген з бактерії Vetreoscilla, введено в плазмідний вектор і в стрептоміцет. Промотором була конструкція, що характерна для стрептоміцетів.

Отримані трансформанти культивувались в середовищі з низьким О₂, швидкість росту збільшилась і рівень синтезу актинородину збільшилась в 10 разів.

4. Створення нового шляху синтезу антибіотику

Було сконструйовано плазміду, що містила ген з зміненим ланцюжком біосинтезу цефалоспорину. Цю плазміду вбудували в гриб Acremonium chrysogenum, інший шлях скорочував шлях утворення антибіотиків і зменшував кількість побічних продуктів.

Гени, що використовувались при створенні плазміди були взяті з грибів Fusarium solari, Pseudomonas diminuta.

Дата добавления: 2014-01-07