Тема: Получение биологических удобрений

Лекция № 14

Раздел: “Сельскохозяйственная биотехнология”

План:

1. Получение ризоторфина (нитрагина).

2. Получение азотобактерина.

3. Получение фосфобактерина.

В природных условиях плодородие почв тесно связано с жизнедеятельностью сапрофитной микрофлоры. Почвенные микроорганизмы выполняют целый ряд функций, важнейшая из которых - минерализация органического вещества и фиксация атмосферного азота. Современный этап интенсификации сельского хозяйства, связанный с широким при­менением минеральных удобрений, химических средств защиты расте­ний отрицательно сказывается на полезной микрофлоре. В результате почва обедняется, ухудшается её качество и плодородие. Кроме того, химические удобрения вымываются из почвы, отравляя реки и озёра, губя рыбу. В то же время за счет сапрофитной микрофлоры вполне можно пополнять почву органическим азотом, фосфором и др. элементами. Биологический (микробиологический) азот, в отличие от удобрений, почти не загрязняет окружающую среду. Его легко нара­батывают микроорганизмы, фиксируя атмосферный азот, запасы кото­рого велики (78% атмосферы).

1.Получение ризоторфина (нитрагина).

Сложность азотного питания растений сводится к тому, что запасы доступных для них соединений этого элемента в почве незначи­тельны. С урожаем зерновых ежегодно выносится из почвы 50—90 кг азота на каждые 10 центнеров зерна. Азотфиксаторы же создают ес­тественное плодородие почвы, и человечество до появления химически связанного азота использовало лишь биологический азот.

В настоящее время азотфиксирующих микроорганизмов известно довольно много. Среди них есть и симбиотические и свободноживущие виды. Из них наибольшее значение для повышения урожая сельскохо­зяйственных культур имеет использование клубеньковых бактерий. Азотфиксирующие микроорганизмы, образующие клубеньки на корнях бобовых, относят к родам Rhizobium и Bradirhizobium. Бактерии "узнают" своего хозяина (бобовое растение) по гликопротеину - лектину, расположенному на корневых волосках. При внедрении Rhizobium в корневые волоски, образуются так называемые инфекционные нити, в которых находятся размножающиеся бактерии. Такие нити проникают в кору корня и достигают тетраплоидных клеток, после чего начинают формироваться клубеньки. В зрелом клубеньке на про­дольном срезе можно выделить четыре типа тканевой дифференциации: кора, меристема, бактероидная зона и сосудистая система. Бактероидная зона занимает центральную часть клубенька, причём в начале формирования клубенька клетки находятся в обычной форме, а затем образуют бактероиды, которые фиксируют молекулярный азот. Появ­ление клубеньков происходит во время развития первых настоящих листьев, и у однолетних растений. Функционируют они не долго - некроз начинается во время цветения растения. Часть бактероидных клеток лизируется, другая попадает в почву в виде мелких кокков. Фиксация молекулярного азота клубеньковыми бактериями ведет к образованию аммиака, из которого затем синте­зируются аминокислоты. Процесс азотфиксации часто сопровождается выделением молекулярного водорода:

N₂+8H⁺+8e+nATФ à 2NH₃+H₂+nАДФ+nФ

Многие клубеньковые бактерии содержат гидрогеназу, которая катализирует окисление водорода, в результате чего происходит его рециклизация. В образовании из азота аммиака и водорода участвует фермент – нитрогеназа, состоящая из Компонента I — молибдоферредоксин (железо-молибденсодержащий белок) и из Компонента II - азоферредоксина (железосодержащий белок).

Нитрогеназа образуется и активна лишь в анаэробных условиях, поэтому в клубеньках имеется железосодержащий пигмент - леггемоглобин, который обратимо связывает молекулярный кислород. В последние годы показана возможность фиксации азота и чистыми культу­рами некоторых азотфиксаторов в условиях низкого парциального давления кислорода.

Сразу после открытий явления симбиотрофной фиксации молеку­лярного азота возникла мысль использовать ее для практических це­лей. Сначала для этого применяли почву, на которой выращивались бобовые культуры, ее разбрасывали на площадях для посева бобовых там, где они раньше не выращивались. Более эффективным оказалось собирание с корней бобовых клубеньков, которые затем подсушивали и тонко размельчали. Таким материалом, с добавлением талька и бентонита, обрабатывали семена бобовых перед посевом.

В 1896 г. в Германии Ноббе и Гильтнер изготовили коммерчес­кий препарат, содержащий смесь клубеньковых бактерий - "нитра­гин". В нашей стране в 30х гг. такой препарат изготавливали на торфе и называли его "ризоторфин". Этот препарат наиболее эффек­тивен при использовании под сою, люпин, люцерну, кормовые бобы. При этом наряду с увеличением урожая за счет существенного повы­шения содержания белка в растениях, улучшается его качество. Про­цесс производства ризоторфина включает следующие стадии:

А. Выращивание и хранение культуры клубеньковых бактерий:

Для выращивания используют растительные экстракты (отвары бобовых культур), а также дополнительно обогащают сахарами (глю­козой, смесью сахарозы с глюкозой) или маннитом. Пробирки ее ско­шенным агаром засевают соответствующим штаммом и выдерживают при 28-30°С от 4 до 10 суток. Выросшие культуры хранят в холодильнике (3-5°С).

Б. Получение жидкой культуры (инокулята).

Жидкую культуру клубеньковых бактерий получают выращиванием в качалочных колбах или 5-ти литровых бутылях. При этом в колбу на 750 мл наливают 200 мл среды, а в 5-ти литровую бутыль – 2 литра. Бактериями с одного косяка засевают одну колбу. Бутыль за­севается 3-5% жидкой культуры, полученной в колбе. Выращивают 48-96 часов. Полученную культуру охлаждают до 10—15°С и использу­ют для инокуляции торфа.

В. Подготовка торфа.

Для производства ризоторфина используют преимущественно кис­лые или слабокислые торфа (рН 3,0-6,0), предпочтительно древесно-осоковые и осоковые. Отобранный торф очищают, высушивают (до 25-30% Н₂О), размалывают (диаметр частиц - 0,1 мм), загружают в смеситель, увлажняют (до 35-40% Н₂О), прибавляют мел (до рН 6,8-7,0), перемешивают и фасуют в пакеты по 150-160 г, запаивают.

Г. Стерилизация.

Облучение торфа гамма-излучением дозой 2,5 Мрад. Обеспечивает практически полную стерильность субстрата-носителя.

Д. Инокуляция и хранение препарата.

В стерильный пакет с торфом вносят жидкий инокулюм клубень­ковых бактерий. До инокуляции в жидкую культуру вносят дополни­тельно стерильные растворы углеводов. Инокулированные пакеты заг­ружают во вращающийся барабан на 3-5 мин для перемешивания торфа с жидким инокулюмом. Хранят при 5-15°С (до 6 месяцев).

Применяют ризоторфин следующим образом:

1.Предпосевная обработка семян бобовых в день посева 200 г/га на норму семян.

2. Суспендируют ризоторфин в соответствующем количестве воды и этой суспензией обрабатывают семена.

3. Внесение суспензии бактерий глубже расположения высевае­мых семян.

2. Получение азотобактерина.

В богатых органическим веществом, хорошо дренированных и ув­лажненных почвах значительное место занимают свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы. Большой интерес вызывают ассоциатив­ные азотфиксаторы –Azospirillum, обитающие в ризоплане и гистосфере корней - фиксация азота в значимых величинах имеет место в ассоциации азоспирилл с С₄-растениями — кукурузой, сахарным тростником, просом. Во Вьетнаме и некоторых других южных странах в качестве зеленого удобрения используют водный папорот­ник - азоллу, в полостях листьев которого обитает азотофиксирующая цианобактерия Anabaena azollae. Азоллу выращивают в особых прудах и вывозят на рисовые поля. Ведется изучение свободноживущих азотфиксирующих цианобактерий в целях их использования для обогащения почв соединениями азота.

Особое место среди свободноживущих азотофиксаторов занимает азотобактер. При выращивании овощных культур - салата, томатов, огурцов отмечалось благотворное влияние жидкой культуры азотобак­тера на урожайность. Им обрабатывали корни рассады. Увеличение урожая было связано с образованием биологически активных веществ этими бактериями — антибиотиков, стимуляторов роста, витаминов. Вклад же в азотфиксацию был невелик. Однако в настоящее время исследуется возможность модификации Azotobacter с целью производства биологического удобрения азотобактерина.

Технология получения сухого азотобактерина. Азотобакте­рин — бактериальное удобрение, приготовленное на основе куль­туры свободноживущего почвенного микроорганизма Azotobacter chroococcum, способного фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использованного сахара. Более того, внесенные в качестве удобрения бактерии выделяют в почву биологически активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гибберелин и др.), стимулирующие прорастание и развитие растений, а продуцируемые ими фунгицидные вещества из группы анисомицина угнетают развитие некоторых нежелательных микроскопических грибов в ризосфере растения.

Все виды азотобактера — строгие аэробы. Микроорганизмы особенно чувствительны к наличию в среде фосфора в виде органических и неорганических соединений и развиваются при высоком содержании его в питательной среде. Недостаток фосфора замедляет развитие бактерий и снижает азотфиксирующую способность. Многие виды азотобактера фиксируют азот только в среде, обедненной или вовсе лишенной связанного азота. Азотфиксирующая способность культуры подавляется аммиаком, стимулирующее воздействие на азотфиксацию оказывают соеди­нения молибдена (иногда ванадия).

Установлено, что при фиксации азота процесс его восстанов­ления протекает целиком на одном и том же синтезируемом азотобактером ферментном комплексе и лишь конечный продукт (аммиак) отделяется от фермента. Ответственная за фиксацию нитрогеназная система представляет собой мультиферментный комплекс, содержащий не связанное с геном железо, молибден и SH-группы.

Микробиологическая промышленность выпускает несколько видов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной.

Технология получения сухого азотобактерина имеет много общего с технологией производства сухого нитрагина, поэтому будут рассмотрены только наиболее существенные отличия в его технологии.

Азотобактерин сухой представляет собой активную культуру высушенных клеток азотобактера с наполнителем. В 1 г сухого препарата должно содержаться не менее 0,5 млрд. жизнеспособ­ных клеток.

Культуру микроорганизма выращивают методом глубинного культивирования на среде, содержащей все те же компоненты, что и при культивировании клеток Rhizobium. Дополнительно вводят сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты. рН среды культивирования 5,7—6,5, аэрация — 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин.

Процесс ферментации проводят до начала стационарной фазы роста культуры, так как в этой стационарной фазе биологи­чески активные вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости. При этом существует опасность, что с их выходом клетки могут утратить способность фиксировать атмосферный азот после внесения в почву.

Биологически активные вещества полностью или частично мо­гут теряться и в процессе высушивания клеток, однако оставши­еся жизнеспособными клетки после выведения азотобактера из анабиоза восстанавливают способность продуцировать биологи­чески активные вещества. Высушенную культуру стандартизуют путем добавок необходимого количества наполнителя и фасуют в полиэтиленовые пакеты по 0,4—2 кг. Пакеты герметизируют и хранят при температуре не выше 15°С в течение не более 3 мес.

3. Получение фосфобактерина.

Если запасы азота практически безграничны и возобновляются благодаря микробиологической азотофиксации, то запасы фосфора весьма умеренны и быстро истощаются. Биогеохимический круговорот фосфора, не имеющего газовые форм, носит неблагоприятный характер, этот элемент в значительной степени необратимо вымывается в Мировой океан. Кроме того, усвояемость фосфорных удобрений более чем в два раза ниже усвояемости азотных. Поэтому исследование микробиологической трансформации фосфора в почве очень актуальны. В почве имеются микроорганизмы, способные при наличии доступного органического вещества высвобождать ортофосфат из труднодоступных растениям соединений с кальцием, железом и алюминием: Radiobacter, Aspergillus. Ион фосфата настолько быстро связывается в поч­ве, что полезное применение этих микроорганизмов может иметь ре­альное значение только в пределах ризосферной зоны, где существует градиент движения питательных веществ из почвы в корень, а также достаточно доступного органического вещества для активной жизнедеятельности микрофлоры.

Большой вклад в снабжение растения доступным фосфором вносят эндомикоризные грибы (облигатные симбионты). Они развиваются внутри тканей и клеток корня и не растут на искусственных пита­тельных средах. Одна из особенностей таких грибов - отсутствие специфичности относительно растения—хозяина. Кроме того, эндомикоризные грибы резко усиливают поглощение из почвы не только фосфора, но и азота, калия, кальция, натрия, магния, железа, марганца, меди, бора, цинка, серы и др. элементов.

Наиболее широко распространена везикулярно-арбускулярная форма эндомикориз. Грибы, образующие микоризу этого типа, отно­сятся к семейству Endogonaceae: роды Glomus, Gigaspora, Acaulospora, Sclerocystic. Проникая в корень, эндофиты образуют в нем хорошо развитый несептированный мицелий с гифами толщиной 8-12 мм и характерными внутренними структурами.

Арбускулы образуются в клетках растения—хозяина в результате дихотомического деления гиф и по виду напоминают маленьких деревца. Везикулы - сферические или овальные вздутия в середине или на концах гиф. На поверхности корня формируется наружный мицелий с гифами, на концах которых образуются крупные покоящиеся споры. Именно за его счет значительно увеличивается поглощающая поверхность корневой системы, растения получают пи­тательные вещества далеко за пределами зоны действия корневых волосков. Это особенно важно при усвоении малоподвижных, слабодиффундирующих в почве ионов, главным образом фосфатов. Кроме того, в луговом разнотравье эти грибы могут образовывать микоризные мостики—везикулы, мостики между корнями растений разных систематических групп, что позволяет обмениваться разнообразными веществами и продуктами.

Эндомикоризные грибы поглощают из почвенного раствора фосфат, который перемещается по гифам в виде полифосфатных гранул и локализуется в арбускулах. После их разрушения ферментами расте­ний, доступный фосфор высвобождается в ткани корня.

В настоящее время эндомикоризные грибы применяются преимущественно в виде почвенно-кормовых смесей, содержащих определенную культуру эндофита. Использование такого инокулюма возможно только на весьма ограниченных площадях, например, для восстановления плодородия при биологической рекультивации нарушенных земель. При этом улучшается минеральное питание, приживаемость растений и урожайность.

Другой препарат, также носящий название фосфоробактерин получают следующим образом.

Фосфоробактерин — бактериальное удобрение, содержащее споры микроорганизма Bacillus megaterium var. phosphaticum. Однородный порошок светло-серого или желтоватого цвета. Бактерии обладают способностью превращать сложные фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды и др.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты (пирофосфаты, полифосфаты) в доступную для растений форму. Кроме того, бактерии вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновую и никотиновую кислоты, витамин B₁₂ и др), стимулирующие рост растения, особенно на ранних стадиях его развития.

Фосфоробактерин не заменяет фосфорные удобрения и не действует без них. Относится к числу препаратов, обладающих стимулирующим эффектом.

По морфологическим признакам Bac. megaterium var. представляет собой мелкие, грамположительные, аэробные спорообразующие палочки размером (1,8—2,0) X X (5—6) мкм. Клетки содержат значительное количество соеди­нений фосфора. В ранней стадии развития это подвижные оди­ночные палочки, которые в процессе роста утрачивают свою подвижность, а при старении образуют эндоспоры разме­ром 0,7Х1,2 мкм, локализующиеся к одному из концов клетки.

Поскольку используемый микроорганизм — спорообразующая культура, технология выращивания микробных клеток сводится к получению спор. Однако технология производства фосфоробактерина в целом мало отличается от таковой для сухого нитра­гина и азотобактерина.

Технология получения фосфоробактерина. Культуру Bac. megaterium var. на всех стадиях производствен­ного культивирования выращивают глубинным способом.

Культивирование проводят в ферментере в строго асептиче­ских условиях при постоянном перемешивании и принудительной аэрации до стадии образования спор. Основные параметры про­ведения процесса: температура 28—30°С, рН среды 6,5—7,5, длительность культивирования 1,5—2 сут. При выращивании на 1-й среде титр клеток в готовой культуральной жидкости составляет 2,7—3 млрд. спор в 1 мл, на 2-й — 4,3 млрд. в 1 мл.

Полученную в ходе культивирования биомассу клеток от­деляют центрифугированием и высушивают в распылительной сушилке при 65—75°С до остаточной влажности 2—3%. Высушенные споры смешивают с наполнителем (каолином). Приготовленный таким образом готовый препарат должен со­держать в 1 г не менее 8 млрд. клеток. Его расфасовывают по 50—500 г во влагонепроницаемые пакеты и герметизируют.

В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфоробактерин обладает большей устойчивостью при хранении. Потеря жизне­способности клеток после 1 года хранения не превышает 20%.

Фосфоробактерин рекомендуют применять на черноземных почвах, которые содержат наиболее значительное количество фосфорорганических соединений. Он необходим для повышения урожайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и других сельскохозяйственных растений.

При внесении препарата в почву семена растений обрабаты­вают механизированным способом в машинах для сухого про­травливания семян смесью фосфоробактерина с наполнителем (глиной, почвой или просеянной золой) в соотношении 1:40. На одну гектарную порцию семян требуется 5 г препарата и 200 г наполнителя. Клубни картофеля, равномерно увлажняют суспензией спор, приготовленной из расчета 15 г препарата на 15 л воды. Это количество расходуется на одну гектарную норму посадочного материала. Применение фосфоробактерина повышает урожай на 10%.

Дата добавления: 2014-01-07