Дифференциальное центрифугирование

Метод замораживания-скалывания

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода "замораживания - скалывания". С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (- 196╟ С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика (или отпечаток) с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе.

Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.

После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить - разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.

То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода ≈ фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.

Ну и вообще, чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.

Дата добавления: 2014-01-06