Исследование ботанических объектов

Волосы сходны и могут принадлежать одному и тому же человеку.

Волосы не сходны между собой и, следовательно, происходят от разных людей.

Ботаника — наука в значительной степени описательная (дескриптивная). Основоположник научной медицины — врач Древней Греции Гиппократ (470—377 гг. до н. э.) — описал 236 лекарственных растений. Немало способствовали развитию дескриптивного подхода философы: древнегреческий философ, естествоиспытатель и ботаник Теофраст (372—287 гг. до н. э.) создал большой для того времени труд «Исследование растений», в котором описал около 500 растительных организмов. Многие поколения биологов стремились словесно дать пред­ставление о видимом ими разнообразии растений. Отсюда стрем­ление как можно более подробно описать все детали исследуе­мого объекта. Эти детали, т. е. внешние, фиксируемые невоору­женным глазом особенности живого организма, являются его морфологическими признаками.

В середине XVII в. англичанин Роберт Гук (1635—1703) открыл ячеистое (клеточное) строение растений, что положило начало развитию их анатомического изучения, т. е. исследова­нию внутреннего, микроскопического строения.

Наблюдения Р. Гука продолжили и расширили его совре­менники: итальянский ученый М. Малышги (1628—1694) и английский исследователь Н. Грю (1641—1712), впервые опи­савшие клеточное строение различных органов растений. Рабо­тами М. Мальпиги и Н. Грю было положено начало особому разделу ботаники — анатомии растений. Клеточная теория объяснила разнообразие структур, наблюдаемых у растительных и животных организмов, и сравнительно быстро завоевала всеоб­щее признание, но отсутствие необходимой оптики еще долго не позволяло анатомическому методу распространиться достаточно широко. Преобладающим методом оставалось описание: в XVIII в. ботаники уделяли много внимания описанию новых растений.

С развитием оптической инструментальной базы ботаники приобрели более широкое поле зрения — теперь они могли описывать не только внешнее, но и внутреннее строение расти­тельных организмов. Поэтому микроскопический метод исследо­вания растений получил название морфоанатомического. Этот метод, несмотря на долгое время использования, не потерял акту­альности и на сегодняшний день. В зависимости от объекта исследования он модифицировался в ботанике на ряд своеобразных методов.

Однако, прежде чем перейти к описанию методов, необходимо остановиться на общих принципах подготовки материала для работы с микроскопом. Необходимо подчеркнуть, что между подготовкой к анализу и исследованием объектов ботанического и зоологического происхождения принципиальных различий не имеется, поэтому нижеизложенные принципы используются как в ботанике, так и в зоологии.

Биологические объекты можно исследовать живыми и фик­сированными. В последнем случае материал для более деталь­ного изучения можно разделить на части и обработать рядом различных красителей, для того чтобы выявить и идентифициро­вать различные структуры. Препараты для исследования готовят по следующей схеме. Сначала производят фиксацию препарата для обеспечения сохранения материала в состоянии, близком к естественному. С этой целью быстро умерщвляют ткани с помощью специального вещества — фиксатора. Таким образом, обеспечивается сохранение изначальной структуры объекта, причем ткани уплотняются настолько, что из них можно готовить тонкие срезы. Далее производят обезвоживание, например, этиловым спиртом, чтобы препарат при необходимости можно было зак­лючить в среду, которая не смешивается с водой, в также потому, что иначе он будет разрушен бактериями. Для придания препарату прозрачности его просветляют, добавляя, например, ксилол.

Для получения очень тонких срезов материал заливают в определенную среду. Препараты для оптической микроскопии заливают в парафин, которому затем дают застыть, для электронной микроскопии используют более твердые вещества — пластмассы или смолы.

Как правило, толщина объектов слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой (8—12 мкм) исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань, и делают срез прямо через бузину и ткань. Для изготовления срезов используют специальное устройство — микротом или ультратом (чрезвычайно тонкие 20 — 100 нм срезы для электронного микроскопа). Для этого используют алмазный или стеклянный нож.

Срезы для оптического микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду, на замораживающем микротоме. В процессе приготовления твердого среза образец сохраняется в замороженном, а следовательно, твердом состоянии.

Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны, поэтому для получения контраста между ними ткани окрашивают. Используют красители в низких концентрациях, не токсичных для живых тканей, которые называются прижизненными (витальными) красителями (метиленовый синий и нейтральный красный). Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду (например, в канад­ский бальзам), которая не пропускает воздух и способна неогра­ниченно долго сохранять срез. Заключенный в среду срез покры­вают покровным стеклом и используют в микроскопических ис­следованиях.

Одной из модификаций морфоанатомического метода исследования является метод эпидермального анализа. Этот метод широко применяется в физиологии растений для выяснения механизма дыхания, газового обмена растительных организмов и проч. В палеоботанике он используется при решении вопроса, каким таксономическим группам принадлежат растения, отпечат­ки которых обнаружены в ископаемых остатках определенных геологических эпох. В фармакогнозии данные о строении эпи­дермы служат для установления принадлежности измельченных растений определенному лекарственному средству, а также одно­родности и доброкачественности лекарственного растительного сырья. В судебно-ботанической экспертизе метод эпидермального анализа широко распространен и применяется для опреде­ления мельчайших частиц листьев, стеблей и других вегетатив­ных органов, в том числе — подвергшихся гниению, высушиванию, воздействию желудочного сока и проч.

Первым этапом анализа является получение слоев эпидермы, освобожденных от мезофилла. Для этого производится выскабливание мезофилла специально заточенным скальпелем. Эта сложная и ответственная операция производится в поле зрения бинокулярного стереоскопического микроскопа системы МБС при увеличении 15—20 крат.

Метод анатомического исследования древесины широ­ко применяется в систематике и морфологии растений для наи­более полной и точной характеристики отдельных видов, необ­ходимой для отнесения растений к определенным таксономи­ческим группам: видам, родам, семействам, порядкам. В лесоводстве анатомический метод используется для определения оптимальных условий произрастания древесных пород в конкретных условиях. В дендрологии он применяется для установления состояния древесины, выявления в ней скрытых пороков, дефектов развития и т. д. В судебно-ботанической экспертизе для решения многих ее задач бывает необходимо определить род древесины. Например, убийство совершено заточкой с укоро­ченной ручкой. В сарае подозреваемого обнаружена, по всей видимости, часть отпиленной ручки. Эксперту требовалось установить, к одному ли роду древесины относятся ручка заточки и часть деревянной ручки, обнаруженная в сарае.

Метод заключается в приготовлении на микротоме срезов древесины в трех направлениях для того, чтобы увидеть все про­дольно ориентированные элементы древесины — сосуды, трахеиды, волокна либриформа, сердцевинные лучи, древесную паренхиму — под разными углами зрения, установить характер их расположения и сочетания с другими элементами.

Исследование древесины на срезах трех ориентации осуществляется в поле зрения любого биологического микроскопа при увеличении от 80 до 200 крат.

Объектом исследования часто является обгоревшая, обугленная древесина. Приготовление из нее срезов без предварительной подготовки невозможно, поскольку она крошится и ломается. Для фиксации хрупких обуглившихся остатков их заливают желатином или помещают в сердцевину веточки бузины. В таких случаях выдержать необходимую ориентацию срезов практически невозможно. Поэтому исследование осуществляется путем учета размеров, количества и расположения отверстий, образуемых осевыми элементами и их порами.

В тех случаях, когда размер представленных на экспертизу частиц древесины исключает возможность приготовления из них срезов, специально для нужд судебно-ботанической экспертизы разработан метод мацерации. Он заключается в разложении, путем термохимического воздействия древесных микрочастиц на составляющие элементы с последующей диагностикой этих элементов по принадлежности к определенному растительному таксону. Этот метод менее точен, чем микроскопический анализ анатомического строения древесины на срезах трех ориентации, так как учитывает только наличие отдельных элементов, а не способы их соединения в специальную ткань. К тому же объект исследования уничтожается, что является негативным моментом для судопроизводства.

Необходимость в исследовании мелких частиц древесины возникает довольно часто. Например, согласно свидетельским показателям травма, послужившая причиной смерти, нанесена отрезком соснового бруса. Перед экспертом ставится задача установить таксономическую принадлежность микрочастиц дре­весины, изъятой из раны на голове трупа.

Частица древесины помещается в щелочную среду (напри­мер, едкий натр) и подвергается термическому воздействию. В ре­зультате связывающие клетки уничтожаются, освобождая тем самым отдельные элементы механической и проводящей ткани, по которым и осуществляется диагностика.

Большое будущее имеют биохимические методы исследо­вания. Электрофорез довольно давно занял прочное место в современной биохимии. С его помощью стало возможно разде­ление большого числа органических соединений, фракциониро­вание которых иным путем было недоступно или вызывало серьезные затруднения. Электрофоретические методы применя­ются для установления видовой принадлежности белков при экспертном исследовании биологических объектов.

В основе метода электрофореза лежит следующее положе­ние. Как известно, прохождение электрического тока через ра­створы электролитов сопровождается передвижением ионов: ка­тионы перемещаются к катоду, анионы — к аноду. Перемеще­ние молекул белка в электрическом поле зависит от величины знака и заряда молекулы, основным источником этого заряда являются аминокислоты. Собственный заряд белков как амфотерных соединений определяется рН среды и особенностями первичной структуры молекулы, в частности, количественным соотношением в молекуле свободных аминных и гидроксильных групп.

В зависимости от рН среды молекулы белка могут заря­жаться как положительно, так и отрицательно. В слабощелоч­ной среде белок ведет себя подобно слабой кислоте и передви­гается в электрическом поле к аноду. В кислой среде молекула белка приобретает положительный заряд и движется к катоду. Регулируя рН среды, можно в широких пределах менять подвижность белка. При электрофорезе скорость передвижения разных белков различна, вследствие чего они мигрируют к катоду или аноду не общей массой, а разделяются на ряд фракций, отли­чающихся по подвижности.

Разновидностями электрофореза являются зональный элек­трофорез, иммунофорез и изоэлектрофокусирование.

При зональном (иначе называемом свободным) электрофорезе разделяемые компоненты белковой смеси перемещаются с постоянной индивидуальной скоростью и локализуются соот­ветственно их электрофоретической подвижности в виде от­дельных зон. В зависимости от того, в какой плоскости происхо­дит разделение, различают горизонтальный и вертикальный ва­рианты зонального электрофореза.

Иммунофорез основан на способности растворимых белковых антигенов и антител иммунной сыворотки диффундиро­вать в геле навстречу друг другу и в месте встречи образовывать дугу преципитации. Принцип метода изоэлектрофокусирования заключается в миграции молекул белка под действием электрического поля в среде с изменяющейся вдоль пути этой миг­рации величиной рН. Молекулы разных белков, имеющие одно и то же значение рН, собираются в узкую зону.

Выявление разделенных при электрофорезе компонентов производится несколькими способами:

• при помощи кислых красителей, связывающихся с белками;

• гистохимической реакцией, специфичной для определенного белка;

• путем окислительно-восстановительных реакций;

• реакцией преципитации с антителами иммунной сыворотки.

При окраске гель после электрофореза последовательно об­рабатывают специальной смесью, содержащей реагенты, фикси­рующие белки, и раствором красителя, после чего избыток крас­ки убирают отмывающим раствором. В случае гистохимической реакции в проявляющийся раствор вводят реагент, специфически взаимодействующий с продуктом ферментативной реакции и дающий при этом окрашенное соединение. При окислительно-восстановительном способе проявления фореграмм в субстрат­ную смесь вводят реагенты — переносчики электронов.

Приборы для электрофореза состоят из двух основных час­тей: камеры и источника питания. Камера изготовлена из орга­нического стекла и представляет собой резервуар, состоящий из двух сосудов — анодного и катодного, каждый из которых раз­делен на две секции. В наружных секциях расположены элек­троды из платины или стальной проволоки, применяемой в зуб­ном протезировании.

Электрофоретический метод применяется для идентифи­кации сортов и гибридов семян различных культур по содержа­щимся в них белкам, что позволяет выделять по спектрам амино­кислот межсортовые различия. С помощью этого метода изуче­ны спектры ряда ферментов более 20 видов злаков. Сравнение с контрольными спектрами семян растений, наиболее часто встре­чающихся в экспертной практике (ржи, пшеницы, подсолнечника, мака, конопли и проч.), позволяет определять их до сорта вклю­чительно. Это особенно важно, когда, например, сравниваемые образцы зерна не имеют никаких видимых различий, поскольку сортовые признаки присущи вегетативным органам, не пред­ставленным на исследование.

Наряду с традиционным морфоанатомическим исследова­нием в арсенал судебно-ботанической экспертизы активно вне­дряются физико-химические методы.

Выше, был описан метод растровой электронной микроскопии для исследования неживой материи. В настоящее время РЭМ получила широкое распространение и в биологии. Этот вид микроскопии позволяет наблюдать поверхности органи­ческих материалов на субмикроскопическом уровне. Основной трудностью при использовании данного метода является то, что биологические объекты мягки, влажны, состоят из элементов с низ­ким атомным номером и всегда с низкой плотностью, они термодинамически неустойчивы, имеют небольшую тепло- и электропровод­ность, а также очень чувствительны к радиационным повреждени­ям. Эти причины приводят к необходимости специальной подготовки биологического материала для такого исследования.

Подготовка биологического образца обычно начинается с его фиксации, в процессе которой из клеток удаляется большая часть ионов и электролитов, равно как и большинство молекул с низким молекулярным весом, таких, как сахара и аминокислоты. Остаются лишь большие молекулярные комплексы. Затем про­изводят обезвоживание.

С целью исключения или уменьшения электрического за­ряда, который быстро скапливается на непроводящем образце при сканировании его пучком электронов с высокой энергией, исследуемую поверхность покрывают тонкой пленкой проводя­щего материала, в качестве которого обычно используют углерод, золото, алюминий, медь, серебро, сплав золота с палладием, хром, титан, олово, кальций и др. Приготовленный таким образом объект считается годным для исследования методом РЭМ.

Преимущество этого вида микроскопии заключается в том, что с его помощью можно зафиксировать некоторые важные характеристики биологических объектов, которые в световом микроскопе плохо различаются или не поддаются изучению во­обще. Метод РЭМ успешно применяется в экспертной практике, о чем свидетельствует следующий пример.

В одном из московских парков на берегу ручья был обнару­жен труп молодой женщины, изнасилованной и задушенной. Со­гласно показаниям нескольких свидетелей был задержан гр-н К., которого в этот день видели в парке, а двое показывали, что он якобы разговаривал с потерпевшей. Подозреваемый признавал, что находился в парке, но всякое общение с потерпевшей отри­цал. На брюках К. в области колен и на пиджаке в зоне локтей были обнаружены наслоения, похожие на пятна зелени. Локали­зация пятен являлась характерной для половых преступлений. Подозреваемый объяснял их появление тем, что прилег на траву, и указывал место. С участка, указанного К., были отобраны образцы произрастающих там растений. Растения отбирались также с места обнаружения трупа, где имелись следы борьбы (подозреваемый категорически утверждал, что к ручью не спус­кался). Одежда К. с зелеными пятнами и образцы отобранных растений были представлены на судебно-ботаническую экспер­тизу. Требовалось установить: образованы ли пятна на одежде К. травой с места обнаружения трупа или же травой с участка, указанного подозреваемым.

Исследование показало, что пятна на брюках и пиджаке образованы листовыми пластинками высших растений. Однако динамический контакт с травой привел к тому, что микроскопи­ческие частицы листьев плотно внедрились в ткань. Извлечен­ные из переплетения нитей, они были непригодны к исследова­нию с помощью светового микроскопа. Тогда эксперт применил метод РЭМ. Этот метод позволил выявить характеристики эпидермального комплекса листьев, имеющих важное таксономи­ческое значение. Было установлено, что на одежде подозревае­мого имелись микрочастицы 4-х видов растений, произрастаю­щих на местах с повышенным увлажнением. Те же растения являлись преобладающими на месте преступления. Напротив, на участке, указанном К., произрастали светолюбивые засухоустой­чивые виды. Таким образом, факт присутствия подозреваемого на месте преступления был подтвержден.

Загрязнение природной среды в настоящее время стало объективной реальностью. Загрязняющие вещества накаплива­ются в тканях растений и либо нарушают жизнедеятельность организма, либо, аккумулируясь в них, представляют потенциаль­ную опасность. Наличие в клетках растений таких продуктов функционирования промышленных предприятий и автомобиль­ного транспорта, как тяжелые металлы (медь, кадмий, цинк, свинец, никель и др.), лежит в основе метода атомно-абсорбционного анализа растительных объектов. Метод имеет важное зна­чение для долгосрочного прогнозирования экологических изме­нений, происходящих в экосистемах, а также весьма перспекти­вен и с точки зрения установления места изъятия растительных объектов, поскольку позволяет анализировать их микроколичества, например, для определения экологической чистоты места произрастания растения (его фрагмента) и сравнения с заведо­мо известным образцом. Анализируются вытяжки, полученные обработкой листовых пластинок (масса листьев 0,5—0,1 г) дре­весных, кустарниковых и травянистых растений разбавленным 7 /о раствором азотной кислоты.

В небольшом поселке, вытянувшемся вдоль шоссе, 20-лет­няя С. с подругами возвращалась домой из бани. По дороге им встретился прогуливающийся с приятелями Ш., который, дура­чась, отобрал у С. гребенку. Девушка побежала за III. и, догнав его на обочине шоссе, повалила на траву, где они некоторое время катались. Однако Ш. гребенку так и не отдал, говоря, что оставит ее на память.

На следующее утро С. потребовала возбуждения уголов­ного дела против Ш., утверждая, что тот прошлым вечером вы­манил ее из дома якобы для того, чтобы вернуть гребенку, завел в лес и изнасиловал. На одежде, изъятой у С. и Ш., имелись наслоения растительных частиц. Согласно показаниям Ш., который категорически отрицал свою вину, фрагменты раститель­ности могли произойти с обочины дороги, где они с С. «возились». Перед экспертом-ботаником ставился вопрос, произошли ли растительные наслоения на одежде потерпевшей и подозре­ваемого с участка, указанного С. как место совершения преступления, или с обочины шоссе.

Наслоения представляли собой части растений, видовая при­надлежность которых была определена путем применения морфо-анатомического анализа. Всего насчитывалось шесть видов растений, но ответить, откуда они произошли, не представлялось возможным, так как все виды являлись повсеместно произрастающими, широко распространенными и могли произойти как с рассматриваемых участков, так и с любых других с аналогичным составом растительности. Здесь следует отдать должное знаниям и инициативе следователя. Он не удовлетворился полученным результатом. Зная, что вблизи загруженных шоссейных дорог почва и раститель­ность аккумулируют выбросы автомобильного транспорта, он поставил вопросы с учетом этого явления: имеются ли в расте­ниях на одежде С. и Ш. химические загрязнители, если да, то каков их качественный и количественный состав и совпадает ли он с загрязнениями растений из леса или с обочины дороги.

Методом атомно-абсорбционного анализа было установле­но, что в растительных наслоениях с одежды подозреваемого и потерпевшей имелись тяжелые металлы в том же наборе и в тех же концентрациях, что и с участка обочины шоссе. Напротив, растения из леса практически не содержали тяжелых металлов. Как выяснилось, С. обвинила Ш., надеясь, что он женится на ней или заплатит крупную сумму за отказ от возбуждения дела.

Одним из эффективных методов исследования ботаниче­ских объектов является хроматография в различных вариантах (газожидкостная, люминесцентная, тонкослойная). С помощью хроматографического метода выявляют вещества, входящие в состав биологической субстанции (например, хлорофилл), опре­деляют давность образования на предмете-носителе пятен зеле­ни и устанавливают относительное время нахождения ботан­ческого объекта в определенных условиях (люминесцентная и тонкослойная хроматография). Сравнительное исследование ра­стений, содержащих наркотические вещества, методом газожид­костной хроматографии дает очень хорошие результаты даже при исследовании микроколичеств растений.

Дата добавления: 2014-01-06