Влияние концентрации субстрата. Одним из наиболее важных факторов, влияющих на скорость ферментативных реакций, является концентрация субстрата

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на скорость ферментативных реакций, является концентрация субстрата.

В большинстве случаев график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу (рис. 6.5).

Кривую можно разбить на два участка: участок, на котором согласно закону действующих масс скорость реакции пропорциональна концентрации реагирующих веществ, и участок, на котором скорость реакции не зависит от концентрации субстрата, она постоянна и максимальна.

Числовое значение субстрата, при котором скорость реакции равна половине максимальной скорости, называется константой Михаэлиса К_м.

Основные положения ферментативной кинетики, основанные на взаимоотношениях между ферментами и различными концентрациями субстратов, были разработаны еще в 1913 г. Л. Михаэлисом и М. Ментен. Предложенные ими уравнения, связывающие скорость реакции с концентрацией субстрата, в дальнейшем незначительно видоизменялись, однако общие принципы остались незыблемыми. Согласно этим принципам, фермент Е и субстрат S вступают в реакцию со скоростью, константа которой обозначается к₊₁. При этом образуется комплекс ES, способный диссоциировать на исходные фермент и субстрат со скоростью, константа которой обозначается А:_,. В случае же продуктивной ферментативной реакции из этого комплекса со скоростью к₊₂ выделяются фермент и продукты превращения субстрата. Моносубстратную ферментативную реакцию можно записать следующим образом:

Е + S -^-* ES -^* Е + Р (1)

где Р — продукты превращения субстрата.

В момент времени t концентрация свободного фермента будет равна [Е₀] — [ES]. Если концентрация субстрата гораздо больше, чем концентрация фермента, находящегося в составе фермент-субстратного комплекса, то содержанием субстрата в этом комплексе можно пренебречь. В этом случае скорость образования фермент-субстратного комплекса будет равна:

^=*₊₁[S]-([E₀]-[ES]). (2)

Наряду с образованием фермент-субстратного комплекса возможна его диссоциация со скоростью к__х на фермент и исходный субстрат, а также распад с образованием продуктов реакции, протекающий со скоростью к₊₂. Этот процесс описывается уравнением

^=*_,[ES] + *₊₂[ES]. (3)

В состоянии равновесия скорость образования комплекса и его распада равна, следовательно:

*₊₁([Е₀] - [ES]) • [S] = (*_, + к₊₂) ■ [ES]. (4)

После ряда упрощений получаем:

rpci _ _ [Ер] • [S],,.

^{1 J} [S] + (к₊₁ + *_,)/*+, • ^w)

Л. Михаэлис и М. Ментен постулировали, что скорость реакции определяется как скорость распада фермент-субстратного комплекса (константа скорости равна к₊₂). Следовательно:

u = *₊₂-[ES]. (6)

Подставляя вместо [ES] его значение, из уравнения (5) получаем:

₌ к₊₇[Е₀] ■ [S] _т

[S] + (к₊₂ + к_,)/к_+] ■

Упростить это уравнение можно следующим образом: обозначим А:₊₂[Е₀] как V_max, т. е. скорость реакции в условиях, когда весь фермент связан с субстратом, а (к₊₂ + £_,)Д₊₁ как константу Михаэлиса К_м. При подстановке этих величин в уравнение (7) получаем:

Кы + [S]

Уравнение (8) является основным уравнением Михаэлиса—Ментен применительно к моносубстратным ферментативным реакциям. Это уравнение связывает между собой начальную скорость реакции, максимальную скорость реакции и исходную концентрацию субстрата. В случае, если начальная скорость реакции равна половине максимальной скорости реакции, уравнение (8) принимает вид:

(9)

2 К_м + [S] ■

Разделив обе части уравнения на V_mm, получаем:

1= [S3. (Ю)

2 K_w + [S] ^V ">

Решая уравнение (10) относительно К_м, получаем, что К_м равно [S].

Следовательно, константа Михаэлиса численно равна такой концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимальной.

Константа Михаэлиса имеет большое значение при исследовании ферментов; она является весьма важным параметром, характеризующим, в частности, степень сродства фермента к субстрату.

Выражение, обратное уравнению (8), представляет собой:

Это линейное уравнение Лайнуивера—Бэрка, благодаря которому возможно определять в одном эксперименте константу Михаэлиса и максимальную скорость исследуемой ферментативной реакции.

В графическом варианте метод Лайнуивера и Бэрка называют еще методом двойных обратных величин (рис. 6.6). При построении графика на оси абсцисс откладывают величину, равную 1/[S], а на оси ординат — \/V_nax.

В некоторых случаях для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции более перспективным является метод Эди—Хофсти. При использовании этого метода на оси ординат откладывают v, на оси абсцисс — y/[S]. Полученная прямая линия отсекает на оси ординат отрезок, равный V_max, а с осью абсцисс образует угол а, тангенс которого равен V_max / К_м (рис. 6.7).

Дата добавления: 2014-01-07