Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР

Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом.

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминкислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена одного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в гено аминокислоты, приводящему к понижению его активности или, наоборот, улучшению его свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах.

Направленный мутагенез

В качестве эукариотических векторов используются плазмиды дрожжей, искусственные бактериальные хромосомы, вирусы животных и растений.

Для направленного мутагенеза нужно знать последовательность нуклеотидов в районе замены и характер аминокислотных замен. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага М13. Сначала выделяют одноцепочечную ДНК М13 и смешивают ее с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным – за исключением одного нуклеотида – нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (и неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду колона, который нужно изменить. В случае, представленном на рисунке, триплет АТТ, соответствующий изолейциновому кодону, нужно заменить на триплет СТТ, соответствующий лейциновому кодону. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с клонированным геном и послужит затравкой для синтеза ДНК. Синтезированную полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют кишечную палочку. В последней образуются фаговые частицы, что приводит к лизису клеток и образованию зон лизиса. Поскольку из двух цепочек ДНК одна нормальная, а вторая мутантная, половина частиц фага содержит ДНК дикого типа, а половина – мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой.Частица, содержащие только мутантный ген идентифицируют с помощью ДНК-гибридизации (Саузерн-блот), используя в качестве зонда исходный нуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий E.coli-вектор. Мутантный белок синтезируют в кишечной палочке и очищают.

Дата добавления: 2014-01-07