Инсулин. Лекция 13. Генно-инженерные препараты медицинского назначения

Лекция 13. Генно-инженерные препараты медицинского назначения

Метаногены

Группа микроорганизмов, способных использовать углекислый газ в качестве конечного акцептора электронов при окислении молекулярного водорода – это метаногены.

Предположение о бактериальном происхождении СН₄ было высказано в 19 веке. Однако выяснение данного вопроса затягивалось из-за невозможности выделить чистую культуру. Это позволили сделать методы культивирования анаэробов разработанные Хангейтом:

1) принцип удаления кислорода из газов;

2) предварительное восстановления сред.

Метанобразующие бактерии – морфологически очень разнообразная группа, объединяемая двумя общими признаками:

1) строгий анаэробиоз;

2) способность образовывать метан.

Баркер Х. А. (1956 г.) принял в качестве доминирующего признака образование СН₄. Объединил в 3 рода семейства Methanobaciaceae (так они даны в Берги). Сейчас выделяют 7 родов и 10 видов в чистой культуре: Methanosarcina, Methanospirillum, Methanobacterium, Methanogenium.

Специфичность группы – в клеточных стенках нет мурамовой кислоты и D-аминокислот. Клеточная стенка бывает трех типов:

1) пептидогликан особого химического строения – псевдомуреин;

2) из белковых глобул;

3) гетерополисахаридной природы.

Под электронным микроскопом близка к грамположительной. Специфичность липидов в том, что они построены из полярных липидов и простых эфиров: из глицерина и ₂₀С спирта. Нет сложных эфиров.

Запасных продуктов в виде гранул поли-β-оксимаслянной кислоты или гликогена не найдено.

Большинство имеет температурный оптимум при 35–
40°С, но есть и 65–70°С и 20–25°С. Все нейтрофилы: рН=6–8.
В качестве источника углерода большинство используют
углекислый газ, некоторые формиат, метанол, ацетат.
4Н₂ + СО₂ → СН₄ + 2Н₂О.

Существенный вклад в развитие современной фармакологии вносит технология получения рекомбинантных ДНК с помощью методов генной инженерии. Созданные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток растений и животных используются для получения гормонов, большинства известных ферментов, противовирусных вакцин и т.д.

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Молекула инсулина образована двумя полипептидными цепями, содержащими 51 аминокислотный остаток: A-цепь состоит из 21 аминокислотного остатка, B-цепь образована 30 аминокислотными остатками. Полипептидные цепи соединяются двумя дисульфидными мостиками через остатки цистеина, третья дисульфидная связь расположена в A-цепи. Синтезируется инсулин в виде одноцепочечного предшественника – препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и Б цепи соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После ферментативного отщепления С-пептида образуется инсулин.

Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека — треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками.

Свиной и бычий инсулин можно применять для лечения людей. Однако со временем в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, вызывая нежелательные аллергические реакции. Тем более что потребности в препарате инсулина не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы.

С появлением технологии рекомбинантных ДНК впервые стало возможным производить инсулин в крупных масштабах. В 1978 г. были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их в синтетических генов в клетках E.coli. Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3’- концу гена фермента β-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду pBR322. Клетки E.coli трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы и А или Б пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианидом пептид освобождался. Однако замыкание дисульфидных мостиков происходило с трудом.

В 80-е годы XX века американской компанией Genentech разработана технология производства генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ), которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly. В настоящее время ежегодное производство активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина во всем мире превышает 15000 кг.

Нейропептиды

В 1978 г. сотрудниками Института биоорганической химии был осуществлен синтез двух структурных генов, кодирующих нейропептиды лейцин-энкефалин и брадикинин. Синтезированный ген лейцин-энкефалина имел два «липких» конца. Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагментом бактериальной ДНК, содержащим промотор и часть гена белка β-галактозидазы кишечной палочки, в плазмиду pBR322 и обработан смесью рестриктаз EcoRI и BamH1. Полученная рекомбинантная плазмида была трансформирована в клетки кишечной палочки. В результате экспрессии встроенного гена бактерия начала продуцировать гибридный белок, содержащий на N-конце участок β-галактозидазы, а на С-конце – последовательность нейропептида. С помощью бромциана химерный белок расщеплали и получали активный лейцин-энкефалин.

Соматостатин

Созданы различные модификации интерферона, приспособленные для лечения отдельных вирусных инфекций. Например, гибридный гамма-интерферон-сурфактант-ассоциированный белок направлен против легочных заболеваний.

Легочный сурфактант - субстанция, выделяемая альвеолоцитами второго типа, представляет собой комплекс фосфолипидов и специфических сурфактант-ассоциированных белков, выстилающий поверхность альвеолы. Основными белками легочного сурфактанта являются белки А, В, С и D. Белки В и С (SP-B и SP-C) - гидрофобные белки, участвующие в распределении и стабилизации пленки сурфактанта на поверхности альвеол. Эти два белка играют определяющую роль в свойствах сурфактанта. Белки А и D (SP-A и SP-D) - гидрофильные белки с защитными и транспортными функциями.

Основным свойством легочного сурфактанта является способность снижать поверхностное натяжение в легочных альвеолах и таким образом облегчать процессы вдоха и выдоха. Нарушения в системе легочного сурфактанта вносят существенный вклад в патогенез многих заболеваний, в том числе: респираторного дистресс-синдрома новорожденных и взрослых, тяжелых пневмоний, туберкулеза легких, термохимических ожогов дыхательных путей, силикоза и многих других.

Создана генно-инженерная конструкция, в которой объединены гены гамма-интерферона и легочного сурфактанта С - гамма-интерферон-сурфактант-ассоциированный белок С (IFN-SP-C). Гибридный белок может найти применение при терапии туберкулеза легких, тяжелых пневмоний, термохимических ожогов дыхательных путей, силикоза, респираторного дистресс-синдрома и других заболеваний легких. Изобретение позволяет обеспечить адресную доставку в легкие известного иммуномодулятора гамма-интерферона с помощью сурфактанта-С. Преимуществом IFN-SP-C является и присутствие в нем белка сурфактанта С, аналоги которого используются при лечении и профилактике болезней легких, связанных с нарушениями в легочном сурфактанте Рекомбинантная плазмида, содержащая последовательность ДНК, кодирующую гибридный белок IFN-SP-C, под контролем trp промотора pBEU-IFN-SP-C была трансформирована в E.coli и охарактеризована рестриктным анализом и секвенированием. Гибридный белок IFN-SP-C был выделен из бактериальной массы в виде тел включения и очищен препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле. Его правильная структура была доказана масс-спектрометрией MALDI-TOF и С-концевым секвенированием.

Схема рекомбинантной плазмиды pBEU-IFN-SPC. На схеме обозначены: черные стрелки - гены bla и tet, определяющие устойчивость к антибиотикам ампициллину и тетрациклину (ген tet инактивирован в данной плазмиде); гены rep A, cop, tnp R, контролирующие run-away репликацию; серой стрелкой - trp промотор; серым сектором - последовательность гена гамма-интерферона, черным - кДНК hSP-C; отмечены сайты узнавания некоторых рестриктаз.

Дата добавления: 2014-01-07