Заливка

Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывают одним из растворителей парафина, обладающим способностью вытеснять спирт. К таким веществам относятся хлороформ, бензол, толуол, ксилол, сероуглерод и др. Чаще используют хлороформ и бензол. Толуол и ксилол делают кусочки более твердыми.

Обезвоженные и уплотненные кусочки перекладывают из абсолютного спирта в смесь абсолютного спирта и О-ксилола (1:1) на 2-3 ч, а затем в чистый ксилол, где они вначале плавают (выступая над его поверхностью), а затем по мере пропитывания постепенно погружаются.

В процессе удаления спирта ксилол меняют 2-3 раза на протяжении 1-3 ч (в зависимости от свойств объекта и толщины кусочков). При величине кусочка 1 х 1 см его держат в ксилоле 30 мин. Затем, соблюдая принцип постепенного замещения ксилола парафином, помещают объект в смесь из равных частей парафина (желательно мягкого) и ксилола. Эта смесь, застывающая при комнатной температуре, при нагревании до 37°С расплавляется и приобретает жидкую консистенцию. Кусочки находятся в ксилоле - парафине при 37°С в течение 3-6 ч (при 56°С время сокращают до 30 мин -1 ч). При необходимости отсрочить дальнейшую обработку материала, можно после погружения объекта в смесь ксилола с парафином извлечь сосуд из термостата и оставить при комнатной температуре на ночь (или даже на несколько дней) в закрытом состоянии, а затем, вновь расплавив в термостате при 56°С, перенести в рядом стоящий горячий парафин для пропитывания. Излишнее пребывание объекта в растопленном ксилол - парафине ухудшает качество резания.

Для полного освобождения объекта от ксилола кусочки проводят последовательно через две-три порции расплавленного парафина. Время пребывания в парафине зависит от величины кусочков и свойств ткани. Кусочки толщиной 2-5 мм должны в общей сложности находиться в парафине 2-5 ч.

Если объект хорошо обезвожен и не содержит спирта, задержка в парафине не ухудшает качество объекта даже при пропитывании в течение нескольких дней. При наличии же в кусочках остатков воды и спирта результаты обработки ухудшаются прямо пропорционально длительности излишнего пребывания объекта в расплавленном парафине. Парафин для пропитывания можно применять многократно, но при этом нужно строго следить за тем, чтобы не перепутать порции парафина. Для этого бюксы (или стаканчики) необходимо обозначить соответствующими цифрами (1, 2, 3).

После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате. В качестве формочек для заливки используют разнообразные приспособления.

Заливку осуществляют следующим образом. Предназначенный для заливки парафин подогревают до 58—60°С и аккуратно наливают в приготовленную формочку, заполняя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха (хорошо иметь для этих целей высокую фарфоровую кружку ручкой и носиком). Затем подогревают пинцет или металлический шпатель, быстро переносят подготовленный заливке объект в формочку с парафином и ориентируют в необходимом положении.

После этого формочку охлаждают водой (10—18°С). Если заливку производят с помощью металлических угольников, то пластину помещают в плоскую чашку таким образом, чтобы нижняя ее поверхность не соприкасалась с дном сосуда (на стеклянные или металлические палочки). Затем осторожно наливают воду до верхних краев формы (не заливая поверхность) и дают парафину застыть. При заливке в бумажной коробочке ее постепенно опускают в сосуд с водой и оставляют плавать до полного застывания парафина.

В процессе застывания поверхность блока кратерообразно стягивается, что необходимо учитывать при выборе высоты формы. Если форма недостаточно высокая или залита не полностью и парафин лишь тонким слоем покрывает объект, то при застывании верхняя часть кусочка будет выступать из блока. Наклейку блоков производят на деревянные кубики.

Для этого из затвердевшего парафина скальпелем вырезают четырехугольный блок таким образом, чтобы объект со всех сторон был окружен слоем парафина толщиной 1-3 мм. Затем, положив на деревянный кубик небольшой кусочек твердого парафина, расплавляют его горячим металлическим шпателем (или скальпелем), проводят этим же шпателем по нижней поверхности парафинового блока и быстро придавливают его к кубику.

Заливка в целлоидин может быть рекомендована для трудно режущихся объектов и образцов, чрезмерно затвердевающих при парафиновой заливке (декальцинированная кость, кожа, толстые слои гладкой мускулатуры), а также в тех случаях, когда надо избежать воздействия высокой температуры. получаемые при целлоидиновой заливке срезы можно легко и удобно по отдельности проводить через различные растворы и красители. Недостатками метода являются его длительность, трудность изготовления серийных срезов, относительную трудность наклейки срезов и большую толщину получаемых срезов в сравнении с парафиновыми. Следует также подчеркнуть, то целлоидиновая заливка требует применения полностью безводных реактивов, а объекты должны быть безукоризненно обезвожены. В настоящее время данный метод используется достаточно редко, поэтому упоминание о нем носит скорее исторический характер. Заливку в целлоидин применяют: 1. для объектов, имеющих большие полости и лакуны; 2. для объектов, имеющих слои различной консистенции (например, членистоногие); 3. для объектов больших размеров, с которых трудно получить хорошие парафиновые срезы; 4. для изготовления толстых срезов, необходимых для специальных исследований. Преимущества обоих способов - целлоидиновой и парафиновой заливки - скомбинированы в целлоидин-парафиновом методе, при котором объект сперва заливается в целлоидин, а затем заключается в парафин. Заливка в желатин применяется для рыхлых и легко распадающихся тканей, подготовляемых для резки на крио-микротоме, а также при изучении жировых и липоидных включений, не переносящих действия спиртов, ксилола и т.п. При заливке в желатин происходит минимальное изменение объема объекта, что особо важно при изучении интерцеллюлярных пространств, рыхлой соединительной ткани и т.д.