Нуклеиновые кислоты – носители генетической информации

Лекция 10-11.

Наконец мы добрались до информационных потоков в клетке. Полимеры, являющиеся носителями информации являются ДНК и РНК, вместе называются нуклеиновыми кислотами. Вы уже, видимо, знаете, что в ДНК записана и хранится вся генетическая информация о клетке, в ДНК записаны аминокислотные последовательности всех белков, в том числе всех ферментов, осуществляющих все реакции в клетке.

Нуклеиновые кислоты открыли давно, еще в 1868 году, однако их структура оставалась неизвестной до конца сороковых годов. Хотя открывший их Мишер догадывался, что они имеют отношение к наследованию, прямые доказательства этого появились только в 1944 году. Было показано, что ДНК, извлеченная из инфекционных (вирулентных) бактерий стрептококков, вызывающих пневмонию, может трансформировать невирулентный штамм и делать его вирулентным. Позднее был проведен аналогичный опыт с вирусом бактериофагом.

Фрагмент ДНК, необходимый для синтеза одного функционального биологического продукта – белка или последовательности РНК, называют геном. В каждой клетке тысячи генов, и, следовательно, молекулы ДНК очень длинные. Единственная известная функция ДНК – хранение генетической информации. Каковы размеры ДНК? У бактерии E.coli хромосома кольцевая, имеет длину 1.7 мм. Чтобы запихнуть ее в клетку размером 1 мкм, надо ее сильно компактизовать. Но ее не достаточно сложить, надо еще обеспечить доступ к информации.

С РНК дело обстоит сложнее, известно несколько классов РНК, обладающих своей определенной функцией.

1. Рибосомальные РНК (рРНК) – структурные компоненты рибосом, молекулярных машин для белкового синтеза.

2. Матричные РНК (мРНК) (Messenger RNA) – макромолекулы, несущие информацию об одном или нескольких генах, в них переписаны соответствующие последовательности, необходимые для синтеза отдельных (одного или нескольких) белков. мРНК служат для переноса информации к рибосомам.

3. Транспортные РНК (тРНК) (transfer RNA) это молекулы-адапторы, которые обеспечивают перевод из генетического кода на язык аминокислот в белках.

Итак, информация хранится в ДНК, а воплощается в белках, промежуточным звеном на этом пути выступает РНК. Такое направление потока информации в клетках и является содержанием центральной догмы молекулярной биологии. Коротко ее можно сформулировать так «ДНК-РНК-белок». Сначала по матрице ДНК (по участку, соответствующему данному гену) синтезируется мРНК. Этот процесс, переписывания нуклеотидной последовательности с ДНК на РНК называется транскрипцией. Здесь меняется только физический носитель, язык остается тем же. Затем, по данным мРНК на рибосомах происходит синтез белка. Этот процесс перевода с языка нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот называется трансляцией.

Обратимся к химии. Итак, нуклеиновые кислоты – полимеры нуклеотидов. Что такое нуклеотиды? Они состоят из трех частей: азотистого основания, пентозы, и фосфатной группы. Пентоза в данном случае, это рибоза для РНК и дезоксирибоза для ДНК. Пуриновые основания здесь – это аденин (А) и гуанин (G). Пиримидиновые основания – это цитозин (С), общий для ДНК и РНК. Кроме них в ДНК встречается тимин (Т), а в РНК – похожий на него урацил (U). Рибонуклеотиды – мономерные звенья РНК (аденозин, гуанозин, уридин, цитидин), дезоксирибонуклеотиды – ДНК, всё то же, но с приставкой «дезокси». Чтобы не путать нумерацию атомов в основаниях и в пентозах, в последних вводят штрихованные обозначения. Рибо (дезоксирибо)нуклеотиды связаны в полимеры ковалентно посредством «мостиков» из фосфатных групп. Гидроксильная группа 3’ одного нуклеотида связана с 5’ гидроксильной группой другого через фосфатную группу. Отсюда и название соответствующих концов нуклеиновых кислот 5-штрих и 3-штрих.

Получается, что основная цепь такого полимера состоит из чередующихся пентоз и фосфатов, а нуклеотиды образуют как бы боковые цепи. Основная цепь гидрофильна и полярна при рН 7 за счёт фосфатов. рК для фосфорной кислоты около 0, поэтому тут почти все группы депротонированы и заряжены.

РНК подвержены постепенному неферментативному гидролизу в щелочных условиях. К ДНК это не относится. За этот процесс ответственна 2-штрих ОН-группа.

Короткие последовательности называются олигонуклеотиды. Их можно синтезировать искусственно. Длинные последовательности называются полинуклетидами.

Азотистые основания содержат по нескольку двойных связей, поэтому в кольцах все связи частично двойные, а кольца – плоские. Между основаниями возможно два типа взаимодействий. Стеккинг-взаимодействие - это комбинация ван-дер-ваальсова взаимодействия, и диполь-дипольного взаимодействия (дисперсионное взаимодействие). Сами по себе основания плохо растворимы в воде. В результате стэкинг-взаимодействия они образуют как бы стопки монет, что помогает уменьшить площадь контакта с водой. Второй тип взаимодействия между основаниями – это образование водородных связей. Это образование А-Т и G-C пар. Именно этому эффекту обязаны своим происхождением двуцепочечные нуклеиновые кислоты. Образование таких специфических пар обеспечивает возможность копирования генетической информации. Но об этом позже.

Еще до открытия структуры ДНК трудами Чаргофа стало ясно, что

1.) процентное соотношение нуклеотидов зависит от вида организма

2.) ДНК, выделенные из разных тканей одного организма, не отличаются по нуклеотидному составу

3.) Нуклеотидный состав для каждого организма не меняется с возрастом

4.) Во всех организмах A=T, С=G.

Сейчас, когда мы знаем, что каждая клетка организма содержит полный набор ДНК, идентичный в каждой клетке, не меняющийся со временем, знаем, что это двойная спираль, стабилизированная взаимодействием соответствующих оснований в парах, эти правила кажутся очевидными. Но они были получены независимо, когда о структуре ДНК было почти ничего не известно.

Розалин Франклин получила рентген кристаллов ДНК, из которых было видно, что это спираль, в которой прослеживается два периода: 0.34 нм (расстояние между соседними основаниями) и 3.6 нм (шаг спирали). На виток приходится 10.5 пар, толщина спирали – 2 нм. Основания образуют стопку внутри спирали, а основная цепь обращена к воде. Каждое основание одной цепи спарено с основанием другой, они лежат в одной плоскости, почти перпендикулярной оси спирали. Такое пространственное расположение создает большую и малую гидрофобные бороздки. Цепи в ДНК антипараллельны, это было позднее доказано молекулярнобиологическими методами. Цепи ДНК не идентичны ни по последовательности, ни по составу. Двойная спираль (дуплекс) стабилизируется взаимодействиями между основаниями: это водородные связи и стеккинг-взаимодействие.

ДНК может иметь несколько различных структурных форм. Ее молекулы очень подвижны. Вокруг многих одиночных связей в основной цепи возможно вращение. Структура, предложенная Вотсоном и Криком, – наиболее стабильная форма ДНК со случайной последовательностью при физиологических условиях. Ее называют В-формой ДНК. В кристаллической форме существует еще А и Z формы ДНК. А-форма возникает в растворах, где мало воды. Это тоже правая спираль, но с другими параметрами – 0,23 нм между основаниями и 11 пар на виток. Она короче и толще. Неизвестно, встречается ли она в природе. Z-форма более радикально отличается от В, это левая спираль. Расстояние между основаниями 0.38 нм, на виток приходится 12 пар. Z-ДНК была найдена в живых организмах.

Некоторые специальные последовательности нуклеотидов приводят к образованию нестандартных типов структуры ДНК. Например повторы АААА в одной из цепей, содержащие более 4 А (например, 6) вызывают излом в цепи. Такие изломы могут быть важны для связывания некоторых белков.

Часто встречаются последовательности-палиндромы. Такая цепь оказывается комплиментарной сама себе и может образовывать «шпильку» или «крест». Инвертированный повтор их образовать не может.

Н-форма ДНК образуется там, где есть полипуриновые или полипиримидиновые участки, например повторы CT и инвертированный повтор. Там образуется тройная спираль ДНК.

ДНК можно денатурировать, т.е. разделить на две цепи, при повышении температуры или крайних значениях рН. При возвращении в исходные условия ДНК ренатурирует, происходит отжиг цепей. Если хотя бы 10 оснований остались спаренными, отжиг происходит почти мгновенно, цепи захлопываются, как «молния». Если нет – первая стадия процесса замедлена, сначала происходит поиск, потом отжиг. Можно получить и двуспиральную РНК, и гибрид ДНК-РНК (гетеродуплекс). Такие структуры плавятся при более высокой температуре.

Как синтезируется ДНК, откуда она берется? Еще задолго до открытия ДНК ученые задавались вопросом, как организмы создают свои копии. Отсюда пошла идея шаблона «template», матрицы, на которой молекулы могли бы быть собраны в нужном порядке и скреплены, так чтобы получилась макромолекула с уникальной структурой и функцией.

Глядя на структуру ДНК, можно легко себе представить, как происходит воспроизведение записанной в ней генетической информации. Ключевой момент – комплементарность цепей. Одну из цепей можно использовать как матрицу для построения второй. Копирование можно осуществить следующим образом – разделить две цепи, и на место недостающей достроить новую по принципу комплементарности. Каждая существующая цепь служит образцом для синтеза комплементарной.

ДНК дуплицируется по полуконсервативному механизму. Каждая из двух новых молекул, полученных из одной, будет содержать одну старую цепь и одну вновь синтезированную. Это было проверено экспериментально. Как можно пометить цепи? Изотопной меткой. Если выращивать бактерии в почве, с источником азота, содержащего тяжелый изотоп ¹⁵N вместо ¹⁴N, они будут синтезировать меченые азотистые основания. ДНК, содержащую такие основания можно отличить по незначительным различиям в плотности методом центрифугирования. Первое поколение бактерий (ждали, пока масса культуры удвоится) содержало ДНК одинаковой плотности, большей, чем исходная. Бактерии второго поколения содержали половину ДНК такой же плотности, а половину – еще более тяжелой.

Как начинается репликация ДНК? Если взять раствор ДНК, дать ей необходимый материал (мономерные звенья), будет ли она реплицироваться сама собой? Нет! Для репликации нужно много всего. Нужны специальные ферменты. Но это еще не всё, нужна точка начала репликации, специальная последовательность, с которой начинается репликация.

ДНК, содержащаяся в клетках, отличается от произвольной последовательности ДНК, которую мы изучаем в пробирке. Клеточная ДНК организована в хромосомы. Наличие точки начала репликации – одно из требований к ДНК, необходимых, чтобы она стала хромосомой. Хромосомы бактерий (и других прокариотических организмов) – кольцевая, у эукариот хромосомы линейные.

Репликация всегда начинается в определенном месте и идёт в двух направлениях. Образуются репликативные вилки. В этих местах родительская молекула раскручивается, и тут же синтезируются две дочерние цепи. У эукариот есть множество точек начала репликации.

Новая цепь ДНК всегда синтезируется в направлении от 5’ к 3’ концу, поэтому цепь, служащая образцом читается от 3’ к 5’, так как они антипараллельны. Если обе цепи будут синтезироваться одновременно, тогда одной из них придется синтезироваться в другом направлении. Одна из цепей (отстающая цепь), которую в принципе могла бы ждать такая участь, синтезируется не непрерывно, а отдельными фрагментами, которые потом сшиваются. Они называются фрагменты Оказаки.

Синтез новых цепей осуществляет фермент ДНК-полимераза. На самом деле таких ферментов несколько, поэтому им присвоили номера.

Для работы ДНК-полимераз необходимо несколько условий. Во-первых, – это образец. ДНК не возникает de novo, а синтезируется только по уже существующей матрице. Во-вторых, нужна затравка, или праймер, сегмент новой цепи со свободным 3’ концом, т.е. полимераза может только добавлять нуклеотиды к уже существующей цепи. Никакой ДНК-синтезирующий фермент не может инициировать синтез новой цепи ДНК.

Как протекает сама реакция? Для синтеза биополимеров нужна энергия. В случае полисахаридов на одно звено тратится (гидролизуется) одна молекула АТФ. В случае ДНК одна фосфодиэфирная связь гидролизуется в (нуклеотидфосфате), а одна образуется (в ДНК). Такая реакция как бы не выгодна (дельта G=2 кДж/моль). Конечно, надо еще учесть гидролиз пирофосфата, дающий –30 кДж/моль, и обеспечивающий суммарный выигрыш 28 кДж/моль. Но если бы это было всё, полимеризация не шла бы в отсутствии гидролиза пирофосфата, что, как известно из эксперимента вовсе не так. С другой стороны, остается непонятно, как сопрячь энергию гидролиза с синтезом. Надо учесть нековалентные взаимодействия, а именно то, что новый нуклеотид держится на своем месте не просто так, а водородными связями с комплементарным основанием другой цепи и стеккинг-взаимодействием с соседним в своей цепи. Дополнительная энергия этих связей и помогает вести реакцию в нужном направлении.

ДНК-полимеразы очень точные. Одна ошибка приходится на 10^-9 – 10^-10 звеньев. Точность репликации основывается на образовании комплементарных пар. «Неправильное» основание не сможет образовать пару и будет отброшено еще до образования ковалентной связи. Однако этого не достаточно. Было проверено, что полимеразы вставляют неправильное основание 1 раз на 10⁴ – 10⁵ пар. Полимеразы проверяют каждый добавленный нуклеотид, и убирают его, если он не правильный. «Неправильный» нуклеотид может присоединиться, например, если С примет таутомерную форму С*, способную образовать пару с А. Однако, время жизни С* невелико, и такая пара скоро распадается, как только С* возвращается в состояние С. Образно говоря, полимераза сидит и ждет, не развалится ли нуклеотидная пара. Присоединив нуклеотид, полимераза должна двигаться дальше. Однако если нуклеотид неправильный, и пара развалилась, ее перемещение вперед ингибируется. Нуклеотид вырезается, но такая реакция не является просто обратной реакцией для синтеза, гидролизованный пирофосфат никто не вернет, свободная энергия потрачена. Потом полимераза пытается присоединить новый нуклеотид. Такая работа улучшает точность воспроизведения в 100-1000 раз. Получается, что ошибка возникает один раз на 10⁶ – 10⁸. Еще два порядка точности обеспечивает независимая система репарации генома.

На самом деле для дупликации ДНК необходимо около 20 разных ферментов и белковых факторов, вместе называемых реплисомой. Процесс репликации делится на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Разберем этот процесс на примере кишечной палочки E.coli. Скорость движения репликативной вилки составляет 500 пар/сек у прокариот и 50 у эукариот.

Инициация. Репликация начинается в точке начала репликации, последовательности из 245 пар, имеющей 3 13-bp повторов, и 4 9-bp повторов. Для начала репликации надо разделить цепи ДНК и снять топологический стресс. Что это такое?

Для понимания того, как это происходит, надо рассмотреть суперспирализацию ДНК. Обе спирали закручены вокруг общей оси. Изгиб или закручивание самой оси называется суперспирализацией. Если суперспирализации нет, ДНК в релаксированном состоянии. В клетке кольцевые ДНК находятся в суперспирализованном состоянии. Суперспирализация – процесс не случайный. Если ДНК специально не закручивать, она будет релаксирована. Но большинство замкнутых кольцевых ДНК суперспирализованы, и этот процесс регулируется клеткой. Обычно ДНК оказывается раскрученной, т.е. у нее меньше витков, чем ожидалось бы в В-форме. Раскрученность создается специальными ферментами. Чтобы поддерживать ДНК в таком состоянии, надо или замкнуть ее в кольцо или блокировать концы специальными белками, чтобы они не скручивались обратно. Если порвать одну цепь, свободное вращение приведет к релаксации. Целая раскрученная ДНК может снять механическое напряжение двумя способами. Или разделить цепи, или свернуться в кольцо. Скорее она свернется в кольцо, так как тогда не надо тратить энергию на разрыв водородных связей.

Рассмотрим это на примере маленьких кольцевых замкнутых плазмид. Введем «число зацеплений» (Lk). Это число жестко фиксирует число витков в кольцевой ДНК. Даже если убрать все водородные связи и вообще исключить физический контакт цепей, они всё равно окажутся сцепленными. Чтобы это понятие имело смысл, надо чтобы обе цепи были целые. Если мысленно натянуть на одну цепь поверхность, то Lk будет равно тому, сколько раз другая нить пронизывает эту поверхность. Если спираль правая, Lk положительно, если левая – отрицательное. Если уменьшить число зацеплений, на столько же уменьшится и число витков. Плотность суперспирализации (сигма равно дельта Lk, отнесенное к Lk). В клетке это обычно 0.05-0.07. Суперспирализация бывает отрицательной и положительной. Две одинаковые кольцевые ДНК, отличающиеся числом зацеплений, называются топоизомерами. Отрицательная суперспирализация помогает разделению цепей. Для изменения Lk, т.е. для релаксации или раскручивания ДНК существуют ферменты топоизомеразы. Они бывают двух типов: топоизомеразы типа 1 разрывают одну цепь и обматывают вокруг другой, изменяя число зацепления на 1. Топоизомеразы типа 2 (ДНК-гиразы) разрывают обе цепи и меняют Lk на 2.

Инициация репликации.

Это делают ферменты хеликазы. Белок ДНК А (20 копий) связывается с областью 9-повторов, затрачивая при этом АТР. Потом с помощью белка HU они денатурируют ДНК в области 13-повторов. В это место немедленно связывается белок ДНК B, являющийся хеликазой и создающий при содействии ДНК две будущие репликативные вилки. Потом туда связываются белки SSB (single strand binding) белок, чтобы предотвратить ренатурацию. ДНК-гиразы снимают топологичский стресс.

Элонгация. В процессе элонгации работают хеликазы, раскручивающие цепи и гиразы, снимающие топологический стресс. Синтез начинается с того, что праймаза синтезирует праймер ведущей цепи. Затем ДНК-полимераза III добавляет к растущей цепи дезоксирибонуклеотиды. Отстающая цепь синтезируется в направлении, противоположном движению вилки. Для каждого фрагмента Оказаки также нужен свой праймер. Его синтезирует праймосома, белковый комплекс, который движется за вилкой по отстающей цепи и синтезирует праймер. Потом ДНК-полимераза III продолжает эту нить, пока не дойдет до предыдущего праймера. Тогда ДНК-полимераза I уничтожает праймер и последовательно заменяет его ДНК. Остается последняя «дырка», т.е. отсутствующая связь. Дырку зашивает ДНК-лигаза.

Терминация. В конце концов, две репликативные вилки встречаются. Вновь синтезированные хромосомы оказываются зацепленными друг за друга. Топоизомеразы их расцепляют.

Современная биотехнология позволяет копировать ДНК «искусственным» образом, т.е. в пробирке. Это метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR). Он позволяет получить любое количество копий ДНК из одной единственной молекулы, либо какого-то интересующего фрагмента молекулы ДНК. Сначала раствор, содержащий исходную ДНК нагревают примерно до 80 С, чтобы ДНК денатурировала на 2 отдельные нити. После этого немного понижают температуру и добавляют искусственно синтезированные РНК -праймеры, комплементарные концевым участкам интересующей последовательности. Праймеры «отжигаются» на комплементарные участки ДНК. Затем добавляют фермент ДНК полимеразу, выделенную из термофильных бактерий (Taq) и несколько увеличивают температуру. Фермент связывается с областью, содержащей праймеры, и начинает достраивает вторые цепи ДНК. На этом заканчивается 1 цикл. В последующих циклах нагревания и охлаждения процессы денатурации, отжига и синтеза 2 цепи повторяются. После 3 цикла начинает нарабатываться только выделенная последовательность. После 30 циклов получается уже миллион копий.

См. видео http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html

Дата добавления: 2014-01-07