Birnaviridae

Cystoviridae

Стратегия репликации аренавирусов

• Проникновение в клетку путем эндоцитоза и образование

внутриклеточной вакуоли

• Освобождение вирусного генома

• Транскрипция (-) 3’-концевой части S РНК 􀃆 Образование мРНК

для N – белка

• Транскрипция (-) 3’-концевой части L РНК􀃆Образование мРНК

для РНК-полимеразы (L– белок)

• Транскрипция терминируется с помощью шпильки,

расположенной в центре S и L РНК

• Полиаденилирование и кэпирование транскриптов с помощью ферментативного аппарата клетки

• Трансляция белков N и L происходит до репликации генома

• Репликация генома (антигеномная РНК)

• Транскрипция мРНК для гликопротеинов (GPC􀃆GP1, GP2) и Zincbinding

protein (Z)

• Трансляция GPC и Z – белков

• Сборка нуклеокапсида

• Почкование вирусных частиц от клеточной мембраны, в котором важнуб роль играет Z-белок

(вирус не убивает клетку)

Вирусы с двунитевой геномной РНК (dsРНК)

Двуцепочечная рнк не может служить матрицей, значит, им также нужна рнк-зависимая рнк-полимераза.

Такие вирусы (диплорнавирусы) заражают представителей всех царств животных и бактерии тоже.

Диплонавирусы – это группа(те не сем-во и проч), объединяющая вирусов с двуцепочечным геномом. В группе 6 семейств. По классификации Балтимора наших вирусов относят к группе 3(это важно, нужно знать).

сем. Reoviridae

Геном сегментированный (10-12 сегментов двуцепочечной рнк)

Partitiviridae

2-3 сегмента двуцепочечной рнк, заражают только грибы и растения.

Chrysoviridae

4 сегмента двуцепочечной рнк, заражают грибы.

Totiviridae

1 сегмент дц-рнк(2-максимум), заражают низшие эукариоты, грибы.

Оболочечный вирус (в отличие от остальных), заражает бактерии.

2-3 сегмента дц-рнк, заражает позвоночных и беспозвоночных.

Остановимся на сем-ве реовирида.

Многие представители вызывают опасные заболевания человека и животных

• 9 родов, заражают млекопитающих, беспозвоночных и растения.

• были изолированы из дыхательного и кишечного тракта животных и человека и, на тот момент, не были связаны с каким-либо заболеванием

• Реовирусы человека – респираторные заболевания (дети). Род Rotavirus - диарея у детей. Этот род – причина высокой детской смертности, особенно в Африке и юго-восточной Азии

• Вирус синюхи языка животных (Bluetongue virus)

• Реовирусы растений

– Rice dwarf virus

– Wound tumor virus

• Реовирусы грибов

•Липопротеидной оболочки нет.

•Геном сегментирован (10-12)

•Транскриптаза входит в состав вириона

•Капсид вириона реовирусов образован двумя концентрическими

белковыми слоями - внешним икосаэдрическим капсидом (80 нм) и

внутренним (60 нм)

•Размножается в цитоплазме

Есть даже вирус с 3мя капсидами.

Каждый сегмент моноцистронный.

Транскриптаза является структурным белком внутреннего капсида, активируется при частичном протеолизе внешнего капсида.

Матрицей для транскрипции служит лишь одна цепочка – -рнк.

λ – ферментативные комплексы (структурные при этом тоже), образуют каналы в вершинах икосаэдра реовируса (Лямбда-3- это транскриптаза, лямбда-1 - хеликаза.).

δ – в основном структурные белки. В частности, δ1 является пробкой, для канала(λ) и одновременно рецептором, который играет важную роль при присоединении вируса к инфицируемой клетке.

•Вирус попадает в клетку посредством эндоцитоза, размножаются исключительно в цитоплазме.

•В результате протеолиза (исчезает внешний капсид, остается внутренний, несколько перестроенный) вирусная частица превращается в т.н. субвирусную частицу, устойчивую к протеазам и способную проникать через мембрану эндолизосомы в цитоплазму.

• В цитоплазме происходит окончательная структурная перестройка и превращение субвирусной частицы в т.н. коровую частицу, в которой активируется транскриптазный комплекс, локализованный на

вершинах икосаэдра, открывается вершинный канал и начинается первичная транскрипция.

10 сегментов направляются к вершинам икосаэдра (считают, что икосаэдр, но точно неизвестно) внутреннего кора, где и происходит транскрипция (напомним, только на(–)РНК!). И благодаря ферментативному комплексу образовавшаяся матричная рнк кэпируется, а сегменты генома в свою очередь остаются внутри частицы.

Реовирусы: сборка и выход потомства из клетки.

• Механизм, ответственный за распределение различных сегментов генома между дочерними частицами неизвестен

• Частицы собираются в цитоплазме через 6-7 часов после начала инфекции (тельца включения). Выход из клетки

• Выход частиц из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму клетки

• Накопление

• Лизис клетки

В цитоплазме синтезируются белки, у реовирусов одни и те же белки как структурные, так и ферментативную функцию выполняют. Эти белки образуют некую частицу вокруг +РНК, эта частица обладает транскрипционной активностью, в результате внутри частицы делаются минус цепи и у нас внутри двуцепочечный геном. Дальше частица может обстраиваться структурными белками и может формироваться вирион. Но у многих вирусов(у Ротавирусов, например) белков не хватает для формирования зрелых вирионов и тогда начинается вторичная транскрипция в дочерних частицах и появляется второе поколение мРНК и частиц и тд.

Еще раз о белках:

Внутренний капсид сложен лямбда-1, лямбда-3, мю-2 и сигма-2.

Канал диаметром 8 нм образован лямбда 2.

Лямбда 2 - метил и гуанидилтрансфераза, она кэпирует транскрипты, которые выходят из вирусной коровой частицы, и строит каналы, через которые они выходят.

Лямбда-3- это транскриптаза, лямбда-1 - хеликаза. Все вместе-

транскрипционный комплекс. Белок сигма-1, помимо пробки, обладает

гемаагглютинирующей активностью, это основной антиген, и он

отвечает за взаимодействие с клеткой.

Организация генома ретровирусов

10 двуцепочечных сегментов обозначены заглавными латинскими буквами L, M, S. С L1 образуется лямбда-3. С L2 - лямбда-2. С L3-лямбда-1.

С M1 - мю2(структурный белок и фермент НТФаза), с М2-мю1(белок внешнего капсида, участвует в проникновении через мембрану), с М3-мю-NS+(помогает взаимодействию дочерних двуцепочечных РНК с кором) и

мю-NSC(ф-ции неизвестны). Их два, поскольку старт мю- NSC не в

рамке и делается с некоторой частотой, получаются в результате альтернативного сплайсинга с одной матрицы,видимо, как-то ингибируют ответ клетки, связываются с дц-днк и ингибируют появление интерферона.

мРНК- два белка сигма-1(пробка) и сигма-1S(функции неизвестны, возможно вместе с сигма-2 участвует в сборке и созревании вириона) сигма-NS отвечает за внутрикл. локализацию кора. Сигма-3 - структурный белок внешнего капсида.

Сигма 1 взаимодействует с рецептором---эндосома---

протеолиз---выход кора в цитоплазму---траснкрипция внутри кора (первичная транскрипция)---

трансляция--- инкапсидирование кэпированых +РНК-синтез вторых

цепей --- созревание--- зрелые вирионы.

У ротавирусов немного другая схема - есть первичная транскрипция и трансляция в дочерних частицах, так как не хватает белков для созревания. Вторичная транскрипция: дочерние вир. частицы становятся поставщиками новых матричных рнк. Выход у всех литический. Дочерние, частицы в составе одной вирусной частицы- 12 разных фрагментов

(Сколько их в итоге? 10, 9 или 12?). При этом неясно, как они

пакуются, но собирается он четко (все образующиеся вирионы инфекционны!!!). 6-7 часов инфекционный цикл.

РЕТРОВИРУСЫ

РНК-cодержащие вирусы, которые синтезируют ДНК на матрице РНК.

Ретровирусы (сем. Retroviridae), ss (+) RNA, при этом в каждую частицу входят 2 молекулы одноцепочечной рнк (единственный пример диплоидного генома); окружены липопротеидной оболочкой.

• В жизненном цикле присутствует стадия транскрипции ДНК на матрице геномной вирусной РНК с помощью вирусного фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

• Большое уникальное семейство, включающее вирусы, вызывающие онкологические заболевания, заболевания, поражающие иммунную систему и связанные с дегенеративными и неврологическими синдромами.

• Группа VI (по Балтимору)

Независимо от хозяина (человек, насекомые, млекопитающие и др) ретровирусы очень схожи по структуре генома и способу репликации.

Типичный представитель – вирус саркомы Рауса (SRV).

Общая схема: с +РНК с помощью обратной транскрипции образуется

одноцепочечная ДНК, на ней - двуцепочечная ДНК (с помощью того же фермента), дальше - интеграция в клеточный геном (эта двухцепочечная копия есть провирус), в составе клеточного генома идет транскрипция с помощью клеточного фермента, образуются +РНК, структурные белки- сборка и выход.

Выщепления генома вируса из клеточного генома не происходит,

клетку не вылечить.

Активности ревертазы смотри на картинке выше. РНКаза Н – это удаление РНК из дуплекса РНК – ДНК. Интеграза позволяет ДНК-копии вирусного генома встраиваться в клеточную ДНК. В зависимости от рода все эти функции могут выполняться несколькими белками, а м б одним – двумя, интеграза, например, может быть вместе с другими активностями, а м б на отдельном белке.

Структура вириона

Оболочечный вирус, сферический, диаметром около 100 нм.

Поверхностный гликопротеид построен из 2х типов молекул:

1. Трансмембранный белок ТМ

2. Гликопротеид SU – несет функции адсорбции, необходим для взаимодействия вируса с клеткой.

Матриксный белок (МА)

Капсидный белок (СА). Внутри капсида есть две молекулы мРНК

(вирус-то диплоидный) одетых NC(нуклеокапсидным) белком.

Геном ретровирусов

Молекулы рнк кэпированы и полиаденилированы, однако не являются матрицами в синтезе белка. 2 мол-лы РНК сильно сближены и практически взаимодействуют на уровне водородных связей.

Мол-лы РНК в районе 5 концов сближены на расст около несколько сот нуклеотидов. Близко к этому же концу обе молекулы связаны с клеточными тРНК, которые несут ф-ции затравок при образовании ДНК на РНК. Вид РНК зависит от вида ретровируса. Для вируса саркомы Рауса это триптофановая РНК.

Участок связывания с тРНК называют PBS – участок (primer binding site), его длина – 18 нуклеотидов, играет важную роль в репликации.

Структура генома:

Начнем с регуляторных 5 и 3 концевых элементов (5 и 3 читать как 5 штрих и 3-штрих).

До первого значащего гена находится еще несколько сот нетранслируемых нуклеотидов. U3 – участок также (как и U5) регуляторный.

А теперь о значащей части генома:

Любой ретровирус содержит первые три гена (gag, pol, env), но далеко не все содержат регуляторный ген, в данном случае (в случае вируса саркомы Рауса) это ген src. Белки, построенные с таких генов, связаны с онкогенными свойствами вируса.

Внутри капсида после попадания вируса в клетку и частичного его «раздевания» начинается обратная транскрипция. Синтез первой цепи ДНК на матрице геномной РНК вируса осуществляет ревертаза. Как любой ДНК-полимеразе ревертазе нужна затравка – тРНК. 3' конец тРНК используется

для наращивания ДНК цепи длиной 100 нуклеотидов. Потом РНКаза H

удаляет R и U5 из гетеродуплекса. 3' конец ДНК комплементарен 3'

участку РНК-матрицы. И тут происходит прыжок полимеразы. R участок

ДНК св. комплементарно с R участком РНК. После этого у нас опять

есть свободный 3', можно дальше наращивать ДНК. РНКаза H опять

удаляет из гетеродуплекса всю РНК, кроме полипуринового тракта, он

становится затравкой для синтеза второй нити ДНК, после чего он

тоже удаляется. И у нас есть ДНК структура. Дальше еще один прыжок

за счет комплементарности PBS-участков. У обоих цепей есть

свободные 3' концы, можно закончить синтез в обоих направлениях.

Наша двухцепочечная ДНК получилась длиннее своей РНК матрицы, и

на концах есть повторы. Их называют LTR (длинные концевые повторы). Эти участки важен для регуляции транскрипции и интеграции. Все вместе - провирус.

Дальше провирус интегрируется в геном. В цитоплазме находится

прединтеграционный комплекс, который содержит линейную дц - ДНК, CA,

интергразу (либо в составе ревертазы, либо отдельный белок), ревертазу, матриксный и NP белок. Размеры его велики,

через ядерную пору не влезть. Поэтому интегрируется он во время

митоза. Но у лентивирусов есть механизм активного проникновения в

ядро.

Интеграция происходит неспецифически, т е вирус может встраиваться в любое место генома клетки независимо от нуклеотидной последовательности мишени. На концах провируса есть

инвертированные повторы(2-10 нуклеотидов). Интеграза убирает два

тимидина с двух сторон и одновременно она же вносит в ДНК хозяина

разрывы на расстоянии 5-6 н.п. один от другого и быстро объединяет провирус с ДНКклетки. Клеточные системы репарации заполняют бреши и

удаляют неспаренные нуклеотиды. При интеграции провирус

укорачивается на два терминальных нуклеотида; его концы имеют одну и ту же последовательность. И от 4 до 6 нуклеотидов клеточной ДНК

дуплицированы и фланкируют провирус.

Еще раз:

В РЕЗУЛЬТАТЕ:

• ДНК провируса укорачивается на 2 терминальных нуклеотида LTR по сравнению с неинтегрированной формой провируса;

• Концы интегрированного провируса всегда имеют одну и ту же последовательность 5’-TG….CA - 3’;

• От 4 до 6 нуклеотидов клеточной ДНК, фланкирующих интегрированный провирус, дуплицированы.

Дальше идет транскрипция провируса. После интеграции ретровируса они ведут себя как клеточные гены, их транскрибирует РНК полимераза II. Важную роль в инициации и терминации транскрипции вирусных генов играют LTR- участки. Именно на границе U3 и R находится промотор вирусных генов.

Образуется 2 или 3(если есть src) вида мРНКпри транскрипции провируса. Одна из них полноразмерная, она кэпируется, полиаденилируется. При трансляции полноразмерной мРНК появляется предшественник гена gag или gag+pol, в зависимости от слабого терминатора трансляции. Итак, полноразмерная м-РНК дает реализоваться gag и pol белкам.

мРНК для трансляции SU и ТМ образуется за счет альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК. Также образуется предшественник, содержащий последовательности белков SU и ТМ. Окончательный протеолиз происходит в момент модификации этим предшественником мембраны клетки. Если есть src, то 3-я матричная РНК образуется также за счет альтернативного сплайсинга.

· Взаимодействие с рецепторами

· Попадание капсида в цитоплазму клетки

· Обратная транскрипция

· Образование прединтеграционного комплекса

· Прединтеграционный комплекс во время митоза (для большинства) попадает в ядро и првирус встраивается в геном клетки

· С помощью клеточных ферментов образуется м-РНК

· ПОЛНОРАЗМЕРНЫЕ М-рнк поступают в цитоплазму и транслируются с образованием предшественника и в то же время находятся в цитоплазме как геномные рнк. М-РНК, соответствующие гликопротеидам на ЭР или на АГ транслируются и модифицируются в мембрану ЭР и АГ

· Миграция пузырьков к клеточной мембране и встраивание в нее, здесь окончательный протеолиз гликопротеидов

· Предшественник gag+pol взаимодействует в виде предшественника с геномной РНК и мигрирует к мембране

· Белок в составе предшественника нуклеокапсида начинает взаимодействовать с РНК, а участок предшественника, который соответствует матриксному белку, взаимодействует с гликопротеидами

· Окончательное созревание белков

· Отпочковывание вируса

В лекции того не упоминается, но на слайдах есть, сводная табличка:

Дата добавления: 2014-01-07