Гистохимическое выявление полисахаридов. Приготовление реактива Шиффа и проведение шик-реакции

Полисахариды — высокомолекулярные сахара, встречающиеся в тканях организма как в чистом виде (гликоген), так и в соединении с другими веществами (гликопротеиды, протеогликаны).

Наиболее распространенными методами выявления полисахаридов являются: окраска объектов кармином по Бесту и ШИК-реакция.

1. Выявление кармином по методу Беста — эмпирический способ и не отвечает строгим гистохимическим требованиям. Он широко распространен в гистохимической практике благодаря доступности и яркости. Метод основан на окраске срезов, залитых в парафин или целлоидин, водным раствором кармина. В результате гликоген окрашивается в ярко-красный цвет. При окраске кармином кроме гликогена могут окрашиваться некоторые клеточные гранулы, слизь, кутикулярные каемки эпителия и др. Поэтому всегда следует ставить контроль с диастазой.

2. ШИК — реакция (ШИФФ-йодная кислота). Метод основан на том, что периодат калия при воздействии на полисахариды избирательно окисляет спиртовые группы углеродных атомов гексозной части, превращая их в альдегидные. Свободные альдегидные группы затем реагируют с фуксин-сернистой кислотой, давая фиолетово-вишневое окрашивание.

Приготовление растворов:

1. Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота. 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды (комнатной температуры), тщательно взбалтывая в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 10 мл 1 н. хлористоводородной кислоты и 1 г метабисульфита калия или натрия. Раствор в хорошо закрытой колбе помещают в темное место на 24 ч. После обесцвечивания фуксина реактив приобретает желтоватый или коричневый цвет в зависимости от качества основного фуксина. Для окончательной очистки фуксина от примесей добавляют к нему 3-5 растолченных таблеток активированного угля, хорошо взбалтывают и отфильтровывают в склянку с притертой пробкой. Реактив лучше хранить в холодильнике. С целью проверки качества полученного реактива Шиффа наливают в бюкс 5 мл реактива и добавляют в него 1 каплю неразведенного кислого формалина. Если реактив отличного качества, то он на глазах приобретает цвет основного фуксина.

2. Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 10% раствора гидросульфита натрия (Na2SO3) и 10 мл 1 н. раствора хлористоводородной кислоты. Сернистая вода готовится перед употреблением и должна обладать характерным запахом диоксида серы (сернистого ангидрида (SO2).

Методика проведения окраски препаратов:

1. Материал фиксируют в 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Ценкера, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.

3. При комнатной температуре срезы окисляют 0,5—1 % водным перийодатом калия в течение 2 —10 мин. Раствор хранят в темноте. Рабочую концентрацию этого раствора и продолжительность инкубации в ней подбирают в зависимости от объекта.

4. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.

5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 10-30 мин при комнатной температуре в темноте.

6. Срезы промывают сернистой водой три раза по 2 мин. Сернистую воду можно также готовить (непосредственно до проведения реакции).

7. Тщательно промывают в проточной и дистиллированной воде, ядра можно докрасить 0,5 % светлым зеленым или гематоксилином.

8. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам.

Результат: углеводы, содержащие гексозу, окрашиваются в красно-лиловый цвет, гликоген — в более интенсивный темно-красный.

Контроль: расщепление гликогена амилазой или диастазой, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп.

Необходимо пользоваться химически чистой посудой, стеклянными палочками; нельзя работать с металлическими крючками или иголками; окрашивание срезов в реактиве Шиффа следует проводить в темноте.

При обильном выявлении ШИК-позитивного вещества цитоплазма клеток гомогенно окрашивается в фиолетово-вишневый цвет.

Дата добавления: 2014-01-15