Гистохимическое выявление липидов суданом III и шарлахом

Термин «липиды» охватывает жиры (т.е. триглицериды) и жироподобные вещества растительного и животного происхождения. Это преимущественно неполярные соединения, основным компонентом которых являются жирные кислоты. Липиды нерастворимы или плохо растворимы в воде, но хорошо растворяются в типичных жирорастворителях: бензине, хлороформе, четыреххлористом углероде, ацетоне, эфире, петролейном эфире, горячем спирте и т.п. Не все липиды растворимы в указанных растворителях одинаково, на этом основаны дифференциальная экстракция липидов и выявление их с помощью жирорастворимых красителей.

С учетом гистохимических свойств и химической структуры липиды делят на простые (нейтральные жиры, воски, стериды) и сложные (фосфолипиды, цереброзиды, ганглиозиды, сульфолипиды). Гистохимическая идентификация липидов

Гистохимическое выявление липидов возможно с помощью физических и химических методов. К физическим относятся методы экстракции, поляризационная микроскопия и окрашивание жирорастворимыми красителями, к химическим — подавляющее большинство гистохимических методов выявления липидов, направленных главным образом на определение активных функциональных групп.

Экстракция липидов

В основе методов экстракции липидов лежат законы растворимости, известные из аналитической органической химии. Их необходимо также учитывать при подготовке тканей для проведения гистохимического анализа липидов. Первые потери водорастворимых липидов происходят уже при фиксации в альдегидах или тетраоксиде осмия и продолжаются в процессе обезвоживания и заливки. После первичной фиксации в тетраоксиде осмия вымываются главным образом насыщенные липиды. Особенно велики суммарные потери липидов в тканях, фиксированных в альдегидах. После двойной фиксации в альдегидах и тетраоксиде осмия достигается хорошая стабилизация структур, содержащих ненасыщенные липиды. Наибольшие потери липидов наблюдаются во время пропитки ткани парафином и эпоксидными смолами, но их можно уменьшить путем более быстрого обезвоживания и замены этанола на ацетон. Стабилизация липидов может быть значительно усилена путем добавления к альдегидной фиксирующей смеси хлорида кальция, как, например, в кальций-формоле по Бейкеру или при использовании хроматов, способных окислять ненасыщенные липиды, как в фиксаторе Элфтмана, содержащем бихромат калия и сулему. Хорошо сохраняются фосфолипиды при фиксации с одновременным обезвоживанием в ацетоне с 0,65 % хлоридом магния.

Управляя процессом экстрагирования липидов и применяя его в сочетании с методами окрашивания, гистохимия обеспечивает контроль специфичности окрашивания и дифференцированно выявляет различные липидные фракции.

После экстракции кусочки ткани промывают водой, и криостатные срезы окрашивают раствором судана черного В в 70 % спирте. Следует помнить, что при использовании этого метода не удается полностью исключить диффузию, что затрудняет точную локализацию липидов, однако все же они остаются в срезе и окрашиваются Суданом.

Разработаны приемы липидной экстракции, обеспечивающие хорошую ультраструктурную сохранность ткани для целей электронно-микроскопической гистохимии.

Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Наиболее часто применяют окраску суданом III и красным шарлахом. Указанные красители выявляют все жиры и липоиды, нейтральные жиры интенсивно окрашиваются в оранжево-красный цвет. Для выявления жиров требуется формалиновая фиксация; фиксировать нужно не более 48 часов. После промывки кусочки режут на замораживающем микротоме. Обычные методы заливки применять нельзя, так как эфир, ксилол и крепкие спирты, употребляемые при заливке, растворяют и извлекают жиры из изучаемых объектов.

Метод окраски суданом III и красным шарлахом основан на том, что эти краски хорошо растворяются в жирах. Из насыщенных спиртовых растворов судан III и шарлах красный легко переходят в жир окрашиваемых тканей. Растворимость судана III и шарлаха красного в жирах гораздо выше, чем в спирте.

Окрашивание суданом III является наиболее распространенным методом выявления жира.

Приготовление раствора красителя. В 100 мл горячего 70% спирта засыпают 0,2-0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат (при 58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.

Метод.

1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани) на несколько минут переносят из воды в 50% спирт.

2. Помещают в спиртовой раствор красителя на 15-30 мин (при применении щелочного раствора судана III - на 5 минут).

3. Быстро ополаскивают в 50% спирте.

4. Промывают в дистиллированной воде.

5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном или гематоксилином Эрлиха.

6. Промывают и заключают в желатин или глицерин-желатин

Результат: жировые вещества интенсивно оранжево-красного цвета, ядра - синие.

Окраску срезов раствором судана III следует проводить в бюксе с закрытой крышкой. В противном случае спирт испаряется, и из насыщенного раствора судан III выпадает в виде осадка, который остается в препарате.

Шарлах красный для окраски жира употребляют точно в той же прописи и вполне аналогичным способом, что и судан III.

Окраска шарлахом красным

Красители: в смесь из 50 мл ацетона и 50 мл 70% спирта засыпают 0,2-0,3 г шарлаха. Хорошо закрывают и взбалтывают. Полученный раствор перед употреблением фильтруют.

Метод.

1. Замороженные срезы из свежей или фиксированной в формалине ткани помещают в 50% спирт на 2-4 мин.

2. Окрашивают в растворе красителя 2-3 мин.

3. Быстро ополаскивают в 70% спирте.

4. Промывают в воде.

5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном или гематоксилином Эрлиха.

6. Промывают в воде и заключают в глицерин или глицерин-желатин.

Результат. Жировые вещества оранжево-красные, ядра - синие.

Окраска жира Суданом III и шарлахом красным довольно быстро выцветает, поэтому желательно исследовать препараты вскоре после их изготовления. Окрашенные на жир срезы нельзя обезвоживать и заключать обычным способом: это вызвало бы растворение и извлечение жира из препарата (ксилол, в котором растворяют бальзам, растворит и жиры). Учитывая сказанное, срезы после окраски на жир заключают в глицерин или глицерин-желатин, которые не растворяют жира и хорошо просветляют необезвоженный препарат. Жидкий глицерин не дает возможности фиксировать покровное стекло над препаратом. Для укрепления покровного стекла его по краям покрывают валиком из расплавленного парафина, а лучше из менделеевской замазки. Чтобы добиться хорошего прикрепления покровного стекла, надо, заключая препарат, наносить на него такое количество глицерина, которое не достигало бы краев покровного стекла. После заключения в глицерин-желатин при длительном хранении препаратов наблюдается выпадение судана III в виде красных кристаллов.

Дата добавления: 2014-01-15