Установление первичной структуры белков

24.4.1. Общая стратегия определения первичной структуры белка.

Общая стратегия определения первичной структуры белка сводится к следующим этапам:

1. Расщепление белковой молекулы на более простые фрагменты специфическими методами (химическими, щелочной или кислотный гидролиз, или энзиматическими). При этом олигомеры сначала расщепляют на протомеры, а уже затем их расщепляют на меньшие пептиды или вплоть до отдельных свободных аминокислот

2. Разделение и анализ малых пептидов и свободных аминокислот различными хорматографичскими и масс-хроматографическими методами.

3. Определение последовательности соединения аминокислот в пептидной цепочке, для чего необходимо идентифицировать N- и С-концевые остатки аминокислот. Чтобы достичь цели, необходимо получить небольшие фрагменты пептидов, аминокислотную последовательность которых можно точно установить, используя все ту же общую стратегию

Процедура сложная и трудоемкая, поэтому группа ученых устанавливала структуру гемоглобина 25 лет.

24.4.2. Введение метки в концевую аминогруппу.

В качестве метки часто используют 2,4-динитрофторбензол, который в слабо щелочной среде реагирует со свободной аминогруппой N-концевой аминокислоты:

Из полученной смеси хроматографически легко выделяется

N-(2,4-динитрофенил)аминокислота и идентифицируется методом масс-спектрометрии.

Применяют и другие метки, например, дансилхлорид (1-диметиаминонафталин-5-сульфонилхлорид):

24.4.3. Определение С-концевой аминокислоты.

С-Концевую аминокислоту легче всего можно определить реакцией с гидразином. Происходит гидразинолиз всех амидных связей в белке, но концевая свободная карбоксильная группа гидразинолизу не подвергается, поэтому все аминокислоты пептидной цепи образуются в виде гидразидов

Н₂N-CHR¢-CO-NH-NH₂, тогда как С-концевая аминокислота Н₂N-CHR¢-COОН остается свободной, легко выделяется и идентифицируется.

24.4.4. Последовательное мягкое расщепление белков методом Эдмана.

Этот метод состоит у взаимодействии a-NH₂-концевой группы с фенилтиоизоцианатом (ФТИЦ) в щелочной среде с образованием фенилтиокарбамоилпептида:

Фенилтиокарбамоилпептид

R-производное 3-фенил- остаток полипептида

2-тиогидантоина

При этом образовавшийся фенилтиокарбамоилпептид под действием горячей трифторуксусной кислоты перегруппировывается до производного тиогидантоина.

Уникальной особенностью разложения по Эдману является последовательное отщепление N-концевых аминокислот при сохранении цепочки полипептида, что остается. Повторением таких операций можно анализировать последовательность до 50 аминокислотных остатков в молекуле полипептида.

Дата добавления: 2014-01-11