Инфракрасная спектрофотометрия

При поглощении света в ИК-области спектра (10³ – 10⁵ нм ) происходят переходы между колебательными уровнями основного состояния молекулы (Рис. 3). Спектр поглощения инфракрасного света возникает за счет характеристических движений (изменение длины, величины угла связей) различных функциональных групп (например, метильной, амидной, карбонильной и.т.д). Колебательные спектры очень чувствительны к изменениям химической структуры, конформации, окружения молекулы. В этом смысле инфракрасная спектроскопия не отличается от спектрофотометрии в видимом и ультрафиолетовом свете. И сами ИК-спектрофотометры, принципиально не отличаются спектрофотометров, работающих в области видимого и ультрафиолетового света. Этот метод рассматривается отдельно ввиду того, что имеются некоторые отличия методологического характера.

ИК-спектрофотометр состоит из источника излучений (металлический стержень, нагретый до 1800 – 2000 ºС), монохроматора, кюветной камеры с кюветой, детектора излучений (термопара). Главная трудность использования ИК-спектрофотометра для характеристики биологических молекул состоит в том, что для измерения ИК-спектра, нельзя использовать их водные растворы. Вода имеет очень высокий показатель теплоемкости, соответственно, характеризуется высоким коэффициентом поглощения инфракрасного излучения. Водная среда почти полностью поглощает весь спектр инфракрасного света. Поэтому спектры поглощения макромолекул, находящихся в водном растворе, полностью затушевываются поглощением растворителя. Для измерения спектра макромолекул в ИК-спектрофотометре используют метод сухих пленок. Сухие пленки молекул получают выслушиванием их концентрированных растворов на поверхности пластинок. Конечно, при этом необходимо иметь в виду, что структура макромолекулы в сухой пленке существенно отличается от таковой в водном растворе. Вследствие этих ограничений, ИК-спектрофотометрия, не нашла такого широкого применения в биологических исследованиях, как спектрофотометрия в видимом и ультрафиолетовом свете. Однако, несмотря на это, метод ИК-спектрофотометрии внесла и вносит существенный вклад в исследование структуры макромолекул. При изображении спектров поглощения в ИК- свете используется не длина волны λ, а частота ν или волновое число 1/ ν. Приведем некоторые примеры использования этого метода для исследования биологических объектов и процессов.

1. Определение относительного содержания α-спирали, β-структур, беспорядочного клубка в белках по интенсивности так называемых «амидных» полос (по поглощению NH₂ –группы и C=O – группы).

2. Установление количества водородных связей и функциональных групп, участвующих в образовании водородных связей в макромолекулах.

3. Изучение процессов денатурации и ренатурации молекул белков и НК по изменению числа водородных связей.

4. Определение относительного содержания А-Т (У) и Г-Ц в молекулах нуклеиновых кислот.

5. Изучение взаимодействия между небольшими молекулами, например, белка с лигандом, фермента с ингибитором и т.д.

Дата добавления: 2014-01-11