Основы технологии белковых изолятов из дрожжей

В общем виде схема получения белковых изолятов включает следующие стадии:

• дезинтеграция биомассы;

• экстракция белка и внутриклеточных компонентов;

• удаление нуклеиновых кислот;

• удаление липидов;

• сушка изолята.

Для дезинтеграции клеток предложено большое количество ме­ханических, физических, химических и биохимических (фермен­тативных) методов, а также их комбинации.

Механическое разрушение клеток может быть осуществлено с помощью различного рода дезинтеграторов и молекулярных мель­ниц. По принципу действия механические дезинтеграторы подраз­деляют на баллистические, экструзионные и декомпрессионные.

Баллистический дезинтегратор представляет собой камеру, на­полненную полимерными, стеклянными или металлическими ша­риками, вращающимися одно- или многолопастной мешалкой со скоростью 3000—9000 мин ^-1. В камеру подается суспензия био­массы, и при вращении шариков происходит разрушение клеток. Степень разрушения клеток в баллистических дезинтеграторах до­стигает 95 %.

В декомпрессионных дезинтеграторах суспензия биомассы насыщается газом при давлении около 15 МПа, после этого давле­ние мгновенно сбрасывается, в результате чего происходит разру­шение клеток. Степень разрушения клеток в таких дезинтеграто­рах достигает 85 %.

В экструзионных дезинтеграторах разрушение клеток происхо­дит при продавливании суспензии биомассы через микрофильеры под давлением 50—80 МПа. При этом обеспечивается степень дезинтеграции более 90 %.

Из физических методов широко известна дезинтеграция мик­робных клеток с помощью ультразвука. Этот способ находит ши­рокое применение в лабораторной практике, однако возможность его использования в промышленных масштабах в ближайшее вре­мя маловероятна из-за того, что ультразвуковые генераторы соот­ветствующей мощности пока неизвестны.

Из химических методов деструкции биомассы наиболее извест­ны разнообразные варианты обработки щелочами и кислотами, в результате которых не только разрушаются клеточные оболочки, но и экстрагируются внутриклеточные компоненты. Суть их со­стоит в том, что биомассу микроорганизмов обрабатывают вод­ным раствором щелочи при рН 8—12 или кислоты при рН 1—3 в течение от 30 мин до 2—3 ч.

К недостаткам щелочного гидролиза биомассы следует отнести отмеченные ранее изменения аминокислотного состава белка микроорганизмов.

К биохимическим способам разрушения биомассы относится способ ферментолиза эндо- и экзоферментами. Одним из наиболее популярных способов ферментативного разрушения оболочек клеток является, в частности, обработка биомассы ферментом эндо-β-глюканазой, однако этот метод недостаточно эффективен из-за того, что клеточные стенки микроорганизмов помимо поли­сахаридов содержат также белковые и липидные компоненты, не поддающиеся действию этого фермента.

Для более полного ферментативного разрушения клеточных оболочек биомассу микроорганизмов сначала обрабатывают протеолитическими ферментами: пепсином, трипсином, папаином или фицином. После обработки этими ферментами их инактивируют, биомассу тщательно отмывают и проводят обработку гемицеллюлазами.

Особым способом ферментативного разрушения клеток являет­ся создание благоприятных условий для их саморазрушения (авто­лиза) под действием эндоферментов. Подробно автолиз и ферментолиз дрожжевых клеток будут рассмотрены в следующей главе.

Экстракцию белка можно проводить как кислотами, так и ще­лочами или другими агентами. В частности, японская фирма «Хи­тачи» разработала метод экстракции белка из биомассы дрожжей и бактерий, согласно которому биомассу, подвергнутую химическо­му гидролизу кислотой или щелочью, затем обрабатывают водным раствором мочевины с концентрацией от 2 до 12 г-моль/дм³.

При экстракции белка очень важен его фракционный состав. Согласно классификации Осборна белки по растворимости де­лятся на следующие группы: альбумины — водорастворимые бел­ки; глобулины — белки, не растворимые в воде, но растворимые в водных растворах солей, кислот, щелочей; глютелины — раствори­мые в кислотах и щелочах; проламины — растворимые в 60—80%-м спирте. Биомасса дрожжей обычно содержит около 80 % альбуми­нов и глобулинов, 20 глютелинов, менее 1 % проламинов. При экстракции белка в водную фазу обычно в том или ином количе­стве попадают все его фракции.

Однако в качестве белкового изолята обычно используют толь­ко глобулиновую и глютелиновую фракции белка.

Как уже указывалось ранее, наряду с белком в водную фазу экстрагируются нуклеиновые кислоты и липиды. Эти компоненты способны соосаждаться с глобулиновой фракцией белка, поэтому после экстракции обычно проводят удаление нуклеиновых кислот.

При получении белковых изолятов из дрожжей в основном применяют два способа денуклеинизации — ферментативный и химический.

Ферментативный способ заключается в том, что рН экстракта доводят до значения 5,5—8,5, а температуру до 45...55°С (55 °С, рН 6). В этих условиях активируются эндонуклеазы, содержащие­ся в растворе, тогда как активация протеаз практически не происходит. Нуклеазы гидролизуют высокомолекулярную РНК до ди- и тетрануклеотидов, которые теряют способность соосаждаться с белком в изоэлектрической точке.

Химический способ разделения нуклеопротеидного комплекса основан на действии так называемых хаотропных солей, таких, как фосфаты, перхлораты, натриевая соль ТХУ.

Суть метода заключается в том, что после экстракции в раствор внутриклеточных компонентов вносят хаотропную соль в концен­трации 0,5—1 г-моль/дм³ и после кратковременной инкубации доводят рН до изоэлектрической точки белка (рН 4,5). При этом глобулиновая фракция белка выпадает в осадок, а нуклеиновые компоненты остаются в растворе. Например, в качестве такого ре­агента используют дикалиевую или динатриевую соль ортофосфорной кислоты при соотношении белок:соль от 1:0,1 до 1:5. Выход белка в изолят составляет 90—95 %.

Липиды экстрагируются из биомассы в солюбилизированном с белком состоянии и так же, как и нуклеиновые кислоты, соосаждаются с ним. Поэтому после осаждения белков в изоэлектричес­кой точке проводят их обезжиривание спиртами или сжиженными газами. Обезжиренную глобулиновую фракцию белка промывают и сушат.

Процесс экстракций липидов и нуклеиновых компонентов мо­жет быть переставлен в начало процесса, т. е. проводится обработ­ка не белка, а биомассы. В частности, фирма «Standard Oil Company» (США) предложила способ, включающий следующие стадии:

• экстракция нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей при рН 8,5—10 и температуре 85... 100 °С;

• химическая деструкция биомассы 0,3 н. щелочью при 85... 100 °С и экстракция белка;

• выделение глобулиновой фракции белка в изоэлектрической точке.

Рассмотрим более подробно два реализованных технологичес­ких процесса получения белковых изолятов (рис. 22.12).

Первый процесс разработан в ГОСНИИсинтезбелок и включает механическую дезинтеграцию биомассы дрожжей при рН 6,5—9,5, экстракцию белка при рН 8—10, сепарацию экстракта для отделе­ния клеточных стенок.

В супернатанте проводится активация нуклеаз при рН 7 и тем­пературе 50 °С, и после часовой инкубации глобулиновая фракция белка осаждается в изоэлектрической точке (рН 4,5). Твердая фаза отделяется и подвергается 2—3-ступенчатой экстракции липидов этанолом, водной промывке и сушке.

Второй процесс был реализован фирмой «ЛИКО» (Чехия). Процесс включает следующие стадии: 10%-я суспензия пекарских дрожжей поступает на механическую дезинтеграцию при рН 9—14 и температуре 40 °С. Одновременно с дезинтеграцией происходит экстракция белка и внутриклеточных компонентов. Далее следует сепарация для отделения клеточных остатков. Экстракт подтитровывают до рН 4,5—8,5 для активации нуклеаз. После часовой ин­кубации проводится осаждение белка в изоэлектрической точке (рН 4,5). Осажденный белок отделяют сепарированием, и сгущен­ная фаза подвергается обработке этанолом для удаления липидов, промывке водой и сушке.

При реализации обеих схем получают белковый изолят, содер­жащий не менее 80 % белка, не более 2 % нуклеиновых кислот и не более 1 % липидов. Различия обоих изолятов проявляются только при медико-биологической оценке полученных продуктов. В част­ности, биологическая ценность изолята, полученного на фирме «ЛИКО» в более жестких условиях, допускающих изменение ами­нокислотного состава, равна 44—52 %, тогда как изолята, выде­ленного в ГосНИИсинтезбелок, — 65—70 %.

После осаждения белка в надосадочной жидкости остаются альбуминовая фракция белка, пептиды, нуклеотидные компоненты, соли. Все эти вещества являются ценными продуктами. В частно­сти, альбуминовая фракция белка может быть выделена в виде изолята и использоваться в кондитерской промышленности в ка­честве заменителя яичного альбумина. Ряд пептидов обладает иммуностимулирующей, психотропной и другими активностями. Нуклеотиды также обладают биологической активностью и могут использоваться в пищевой, медицинской и парфюмерной про­мышленности.

Для разделения этих компонентов используют ультрафиль­трацию.

Принцип метода ультрафильтрации заключается в разделении веществ с различными молекулярными массами путем продавливания их через полупроницаемую мембрану. В настоящее время различными фирмами выпускаются мембраны с молекулярной массой удержания или номинальным лимитом молекулярной мас­сы от 500 до 1 млн Да с диаметром пор 2 • 10^-9—6 • 10^-8.

Использование принципа ультрафильтрации для разделения водорастворимых элементов клетки основано на том, что аль­буминовая фракция белка имеет молекулярную массу более 20— 30 тыс. Да, тогда как у пептидов и нуклеиновых кислот она не достигает 10 тыс. Да.

Для разделения пептидных и нуклеотидных компонентов обычно используют хроматографические методы, например ион­ный обмен.

Известно несколько модификаций способа, разработанного специалистами ГосНИИсинтезбелок.

Например, предложен способ переработки биомассы хлебопе­карных дрожжей для получения белка с улучшенными свойства­ми, согласно которому биомассу обезвоженных дрожжей Saccha-romyces cerevisiae дезинтегрируют на кавитационной мельнице в этиловом спирте в течение 30 мин. Из высушенного дезинтеграта с помощью 0,2 н. NaOH экстрагируют белково-нуклеиновый ком­плекс, затем отделяют клеточные оболочки центрифугированием. Из полученного экстракта осаждают белково-нуклеиновый комп­лекс при рН 4. После отделения осадка центрифугированием от­деляют нуклеиновые компоненты путем растворения в буфере с рН 8,9, добавления раствора экзонуклеазы А-5 и инкубирования в течение 24 ч при 37 °С. Белок отделяют путем осаждения в изо-электрической точке. Таким образом получают изолят белка с со­держанием нуклеиновых кислот 1,7 % и гидролизат нуклеиновых кислот с содержанием 5'-мононуклеотидов 60 % и концентрацией остаточного белка 2 %.

Согласно другому способу для получения белкового изолята суспензию хлебопекарных дрожжей, содержащую 10 % сухого ве­щества, измельчают в шаровой мельнице, центрифугируют, оса­док суспендируют в 5-кратном количестве щелочного раствора при рН 12,3. Экстракцию белка при одновременном гидролизе нуклеиновых кислот производят при 70 °С. После отделения кле­точных стенок рН доводят до значения 9 при 10...20 °С и добавля­ют обезжиренное молоко до соотношения в готовом продукте дрожжевого белка и казеина 1:1. Непосредственно после этого минеральной кислотой при рН 4,6 выделяют белок. После центрифугирования белковый осадок промывают подкисленной водой и высушивают. Полученный продукт содержит более 77 % чистого белка, 4,9 % углеводов, 1,7 % липидов и 0,9 % нуклеиновых кислот.

Учитывая относительно невысокую степень очистки (обычно не выше 92—97 % содержания основного компонента) и гетеро­генность большинства потенциально пищевых белков, а также их высокую реакционную способность и сорбционную активность, считают, что белковые фракции, выделяемые из того или иного сырья, могут содержать ряд вредных и нежелательных для орга­низма веществ, присутствие которых полностью исключает или лимитирует применение таких белков для питания. Белок можно считать пищевым, если доказана его безвредность для организма человека.

Доказательства безвредности белка требуют значительно более продолжительных исследований, чем изучение его функциональ­ных свойств и оценка биологической ценности. Происхождение вредных и нежелательных веществ в белковых препаратах может быть различным. Во-первых, это могут быть вещества, содержа­щиеся в исходном сырье. К ним относятся, например, ингибиторы пищеварительных ферментов, олигосахариды, избыточные ко­личества нуклеиновых кислот и т. д. Во-вторых, это могут быть вещества, попадающие в сырье из окружающей среды, например, ионы тяжелых металлов, продукты жизнедеятельности микро­организмов и т.д. В-третьих, это могут быть и вещества, обра­зующиеся в процессах обработки исходного сырья или выделе­ния из него белка, а также остатки веществ, используемых в этих процессах.

Допустимые пределы содержания нежелательных и антипита­тельных (или антиалиментарных) веществ зависят от назначения данного белка, его доли в пищевом продукте и рационе питания. Так, они могут различаться для пищевых белков, играющих роль небольших (1—2 %) функциональных добавок в пищевых продук­тах, и для белков, являющихся основным компонентом пищевого продукта массового потребления и служащих единственным ис­точником белка, например в продуктах питания детей или ново­рожденных.

Таким образом, основные задачи технологии пищевого белка — это извлечение его из сырья с максимальным выходом при мини­мальных затратах и потерях других ценных компонентов сырья, минимальное изменение функциональных свойств белка (или их направленное изменение в желаемую сторону), сохранение биоло­гической ценности белка, достижение необходимой степени уда­ления или дезактивации нежелательных примесей.

Главными лимитирующими аминокислотами белков семян зерновых культур (пшеницы, ржи, кукурузы) являются лизин, триптофан, метионин, поэтому добавление белковых концентра­тов в рецептуры пищевых продуктов из зерна этих культур приво­дит не только к восполнению белка, но одновременно и к увели­чению содержания незаменимых аминокислот.

Белком обогащают хлеб, крупяные, макаронные, кондитерские изделия. В результате увеличивается их биологическая ценность, улучшаются технологические и вкусовые особенности получаемых продуктов.

При введении добавок руководствуются основным принципом, заключающимся в том, что белки и белковые продукты с первой лимитирующей аминокислотой добавляют в таком количестве, чтобы общее содержание этой аминокислоты в белке диетических продуктов было сбалансировано с количеством второй лимитиру­ющей аминокислоты в соответствии с аминокислотной формулой потребности. Содержание первой и второй лимитирующих ами­нокислот должно в оптимальной степени соотноситься с количе­ством третьей лимитирующей аминокислоты и т. д.

В настоящее время наибольшее применение для обогащения пшеничной муки при производстве хлеба и хлебобулочных изделий находит обезжиренная мука из шротов и проростков сои, од­нако в качестве добавок в различные рецептуры все больше прак­тикуется введение продуктов микробного синтеза.

Дата добавления: 2014-01-11