Тройной непрямой метод

Двойной непрямой метод

Прямой метод.

Антиген связывается с антителом, которое конъюгировано с ферментом, в результате работы которого образуется окрашенный продукт. Хромоген – вещество, придающее окраску продукту реакции. Именно отложение хромогена и визуализирует антиген. В качестве ферментов чаще всего выступает пероксидза, обычно – пероксидаза хрена, которая, взаимодействуя с красителем, приводит к образованию окрашенного продукта. Используют также фосфатазы, которые могут давать окрашенные продукты.

Ферменты усиливают реакцию, увеличивая объем продукта. Единичный комплекс антиген-антитело, даже окрашенный, можно просто не увидеть из-за малых размеров.

В иммунофлуоресцентном варианте вместо фермента антитела связаны с флуоресцирующей меткой. Этот вариант выглядит проще, но возникает проблема интенсивности свечения – при малых количествах антигена можно не увидеть мечение. Прямой метод в настоящее время практически не используется в иммуногистохимии, поскольку дает очень слабый сигнал, недостаточный для выявления малых количеств белка в срезах клеток.

В этом варианте неконьюгированные ни с чем АТ связываются с АГ. Затем добавляют меченые ферментом вторичные АТ, направленные против первичных АТ (они теперь выступают в качестве антигена), после чего добавляется раствор субстрат-хромоген. Если первичные антитела получены от кролика или мыши, вторичные АТ должны быть направлены против иммунноглобулинов кролика или мыши соответственно. Этот метод в несколько раз более чувствителен, чем прямой метод из-за того, что вторичные АТ связываются с различными эпитопами первичного АТ. Как следствие, к одной молекуле клеточного АГ присоединяется больше молекул фермента, что приводит к большей чувствительности – усиливается сигнал.

Почему так важно усиление сигнала? По той простой причине, что качественные срезы – тонкие, и количество антигена может быть очень малым. Толстые срезы для иммуногистохимии не годятся, реактивы просто не проникнут в толщу ткани, и в итоге будут артефакты и неспецифическое связывание антител.

В иммунофлуоресцентном варианте флюорохром связан со вторыми антителами.

В тройном непрямом методе добавляется к описанной выше непрямой технике обработка вторым слоем коньюгированных с ферментом АТ. Первичные и коньюгированные с ферментом вторичные антитела добавляются последовательно, далее добавляются третьи антитела коньюгированные с тем же ферментом, специфичные к вторичным АТ. Например, если вторичные АТ получены от козла, третьи антитела должны быть специфичны к козлиному иммуноглобулину. И вторичные, и третичные АТ должны быть коньюгированы с одним и тем же ферментом. Такой подход повышает чувствительность метода, однако увеличивает вероятность ложно-положительных результатов из-за использования разных антител.

Дата добавления: 2014-01-11