Реакция локального гемолиза в геле

Дополнительный материал к занятию

План изучения темы

Исходный уровень знаний

ЗАНЯТИЕ 16

РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА (ИММУННОГО БАКТЕРИОЛИЗА,
ИММУННОГО ГЕМОЛИЗА). РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА. РЕАКЦИИ С МЕЧЕНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ:
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ (РИФ), ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ
АНАЛИЗ (ИФА), ИММУНОБЛОТТИНГ, РАДИОИММУННЫЙ
АНАЛИЗ (РИА), ИММУННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ (ИЭМ)

На данном занятии изучаются реакции иммунитета с участием комплемента и реакции иммунитета с мечеными компонентами (меченые антигены или антитела). Необходимо продумать механизмы и схемы постановки этих реакций. В последние годы перечисленные реакции широко используются для диагностики инфекционных заболеваний и вытесняют традиционные методы (агглютинации, преципитации).

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать о каждой из реакций:

- ингредиенты;

- механизм реакции;

- методы и схемы постановки;

- практическое применение;

- диагностические препараты.

Для усвоения материала необходимо восстановить знания, полученные на предыдущих двух занятиях: комплемент и пути его активации; антигены и антитела; механизмы реакций иммунитета.

Цель занятия

1. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунного бактериолиза и иммунного гемолиза.

2. Изучить механизм и методы постановки реакции связывания комплемента (РСК).

3. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ).

4. Изучить механизм и методы постановки реакций иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинга.

5. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

6. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований.

1. Реакция иммунного бактериолиза.

2. Реакция иммунного гемолиза.

3. Реакция связывания комплемента.

4. Реакция с мечеными компонентами: РИФ, ИФА, РИА. ИЭМ, иммуноблоттинг.

5. Реакции иммобилизации.

После изучения темы студент должен уметь

1. Поставить РСК с готовыми ингредиентами по схеме, учесть и интерпретировать её результат.

2. Учесть и оценить результаты РИФ.

3. Учесть и оценить результаты ИФА.

4. Учесть и оценить результаты иммуноблоттинга.

Реакция предложена Н. Йерне в 1963 г., её применяют для подсчета клеток-антителопродуцентов. Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезёнки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, так как даёт возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и органов и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

ИФА – это выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, β-галактозидазой или щелочной фосфатазой).

Наиболее распространён твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твёрдом носителе, например, в лунках пластиковой микропланшетки из полистирола. Для определения антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют:

- сыворотку крови больного,

- антиглобулиновую сыворотку, меченую ферментом,

- смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путём тщательного промывания. При положительном результате изменяется окраска раствора хромогена в жёлто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).

Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов.

К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА.

Конкурентные методы ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот тест используется для определения количества антигена в исследуемом материале.

Сэндвич-ИФА (метод двойных антител для определения антигена): фиксированные на твёрдой фазе антитела инкубируют с анализируемым антигеном. После отмывания добавляют избыток меченых антител, специфичных к тому же антигену. Несвязавшиеся антитела отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного антигена. Можно использовать немеченые вторые антитела; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых антител, специфичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые антитела должны принадлежать животным разных видов.

Измерение количества продуктов реакции ИФА проводят в автоматизированном варианте в приборах-ридерах с помощью спектрофотометра, по оптической плотности растворов в лунках при определённой длине волны.

Дата добавления: 2014-10-15