Дослід 1. Вивчення окисного фосфорилування в мітохондріях та дії роз’єднувача – 2,4-динітрофенолу на цей процес

Практична робота

Принцип методу. Визначення неорганічного фосфату ґрунтується на здатності амонію молібдату в кислому середовищі приєднувати залишок фосфорної кислоти з утворенням амонію фосфату. Амонію фосфат під дією відновника – аскорбінової кислоти утворює продукти, забарвлені в синій колір. В процесі окисного фосфорилування Ф_н вилучається з інкубаційного середовища, а тому інтенсивність синього забарвлення розчину зменшується.

Матеріальне забезпечення: щойно виділені мітохондрії з м’язів кроля; суміш № 1 – 0,08 моль КН₂РО₄, 0,255 моль KCl, 0,05 моль MgCl₂ розчиняють в дистильованій воді, додають 0,1 М розчин КОН до рН = 7,4 та доводять об’єм в мірній колбі до 1 л; суміш № 2 – водний розчин глюкози з АТФ, що містить 90 мг глюкози та 30 мг АТФ в 1 мл; гексокіназа в 1 %-му розчині глюкози (0,8 мг гексокінази в 1 мл); 5 %-й розчин сукцинату калію; 5 %-й розчин оцтової кислоти; 10 %-й розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАК); 1 %-й розчин динітрофенолу; 2,5 %-й розчин молібдата амонію в 10 М розчині H₂SO₄ (2,5 г молібдата амонію розчиняють в 50 мл 20 М розчину H₂SO₄ і доводять об’єм водою до 100 мл); 5 %-й розчин аскорбінової кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Суміш № 1, мл	1,0	1,0	1,0
Суміш № 2, мл	0,5	0,5	0,5
Гексокіназа, мл	0,5	0,5	0,5
Сукцинат калію, мл	0,5	0,5	0,5
2,4-динітрофенол, краплі	---	---
Суспензія мітохондрій, мл	---	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння, мл	0,5	---	---
Розчин ацетатної кислоти, краплі		---	---
Інкубація в термостаті 15 хв при температурі 37^оС
Розчин ТХАК, мл	1,0	1,0	1,0
Молібдат амонію, мл	0,5	0,5	0,5
Аскорбінова кислота, мл	0,5	0,5	0,5
Результати: спостерігають за появою синього забарвлення

Ацетатна кислота додається для повноти денатурації білка в контрольній пробірці. Після інкубації в термостаті протягом 15 хв при 37^оС в кожну пробірку додають по 1 мл 10 %-го розчину ТХАК; по 0,5 мл 2,5 %-го розчину молібдату амонію та по 0,5 мл 5 %-го розчину аскорбінової кислоти. Впродовж 20 хвилин спостерігають за появою синього забарвлення.

Зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Визначення коефіцієнту окисного фосфорилування використовується з метою характеристики ефективності процесів енергопродукції в тканинах в нормі та при патології. Порушення синтезу АТФ спостерігають за умов дії на організм людини і тварин багатьох патогенних факторів хімічного (зокрема, природні та синтетичні токсини, лікарські засоби, тощо), біологічного (гормони, антибіотики, проміжні продукти метаболізму) та фізичного (іонізуюча радіація) походження. Всі вони спричинюють роз’єднання дихання та окисного фосфорилування за рахунок порушення здатності створювати та підтримувати електрохімічний протонний потенціал на внутрішній мембрані мітохондрій.

Дата добавления: 2014-11-25