Принцип методу. Інсулін дає характерні реакції на білок: біуретову, Геллера, Фоля, Міллона та ін

а) Біуретова реакція (Піотровського) відкриває пептидний зв’язок в білку: до 5 крапель розчину інсуліну додають 5 крапель 10% розчину їдкого натрію, 2 краплі 1% розчину сульфату міді і все перемішують; вміст пробірки набуває фіолетового кольору.

б) Реакція на тирозин (Міллона): до 5 крапель розчину інсуліну вносять 3 краплі реактиву Міллона і обережно нагрівають; в пробірці з’являється цеглисто-червоне забарвлення (утворення осаду ртутної солі динітротирозину);

в) Реакція на амінокислоти, що містять слабозв’язану сірку (Фоля): до 5 крапель розчину інсуліну додають 5 крапель реактиву Фоля, інтенсивно прокип’ячують і додають постояти 1-2 хвилини; з’являється чорний або бурий осад сульфіду свинцю.

г) Нінгідринова реакція: до 5 крапель розчину інсуліну додають 5 крапель 0,5% розчину нінгідрину і злегка підігрівають; спостерігають появу рожево-фіолетового забарвлення, яке згодом синіє.

1. Якісні реакції на адреналін

Принцип методу. Адреналін дає слаболужну реакцію, легко окислюється на повітрі з утворенням адренохрому, внвслідок чого розчин забарвлюється в червоний колір. При взаємодії з нітритом спостерігається жовто-оранжеве забарвлення з діазореактивом – червоне і з хлорним залізом – зелене. Реакція з хлорним залізом характерна для пірокатехінового кільця, яке входить в молекулу адреналіну та норадреналіну. При взаємодії діазореактиву з адреналіном рідина забарвлюється в червоний колір внаслідок утворення складної сполуки типу азобарвника.

а)реакція з хлорним залізом.

Хід роботи. В пробірку наливають 10 крапель розчину адреналіну і додають 1 краплю хлорного заліза. Спостерігається зелене забарвлення. Внаслідок наявності пірокатехіну в молекулі адреналіну. Додають три краплі 10%-го розчину їдкого натрію і спостергають вишнево-червоне забарвлення.

б)діазореакція.

Хід роботи. До 6 крапель 0,5 %-го розчину сульфанілової кислоти додають 6 крапель 0,5 %-го розчину нітрату натрію (суміш діазореактиву), 10 крапель розчину адреналіну і 3 краплі 10 %-го розчину їдкого натрію. Спостерігають червоне забарвлення.

4. Визначення 17-кетостероїдів у сечі.

Принцип методу. 17-кетостероїди – це метаболіти гормонів кори наднирників і статевих залоз. В присутності м – динітробензолу 17-кетостероїди забарвлюються у вишневий колір.

Хід роботи.

До 1 мл сечі добавляють 5-10 крапель 30% розчину NаОН і 5 крапель 2% м-динітробензолу. Струшують і перемішують вміст пробірки скляною паличкою. Через 2-3 хв. при наявності 17-кетостероїдів появляється вишневе забарвлення.

В нормі екскреція 17-кетостероїдів становить 10 – 25 мг за добу у чоловіків і 5 – 15 мг - у жінок.

5. Якісні реакції на фолікулін.

Принцип методу. Якісна реакція на фолікулін (естрон) проводиться з концентрованою сірчаною кислотою (утворення ефірної сполуки солом'яно – жовтого кольору з зеленою флуоресценцією) та на фенольну групу з реактивом Фоліна (поява синього забарвлення).

Хід роботи. 1. Реакція з концентрованою сірчаною кислотою. В пробірку наливають 20-30 крапель спиртового розчину фолікуліну і вміщують її в кип'ячу водяну баню на 5-10 хвилин для відгонки спирту. До фолікуліну, який залишився в пробірці, додають 20 крапель концентрованої сірчаної кислоти і ставлять пробірку знову в кип'ячу водяну баню на 5-10 хвилин. Рідина в пробірці поступово набуває солом'яно – жовтого кольору, яке переходить при нагріванні в оранжеве; при піднесенні пробірки до флюороскопу спостерігають в ній зелену флюоресценцію. З олійним розчином фолікуліну реакцію проводять при кімнатній температурі. До 2 крапель олійного розчину фолікуліну доливають 30 крапель концентрованої сірчаної кислоти, - поступово розвивається солом'яно – жовте забарвлення.

2.Реакція на фенольну групу з реактивом Фоліна. До 2 крапель фолікуліну додають 1 краплю 30% розчину лугу і 1 краплю реактиву Фоліна. З'являється синє забарвлення, зумовлене наявністю фенольної групи.

6. Оформити і захистити протокол.

Лiтература.

1. Методична розробка.
2. Биологическая химия /Воронина Л.Н. и др.- Х.:Основа, 1999. – 640 с.
3. Губський Ю.I. Бiологiчна хiмiя. – Київ-Тернопiль: Укрмедкнига, 2000 – 507 с.
4. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.:Медицина, 1999. – 528 с.

Заняття № 5

Тема: Обмін речовин: загальні шляхи обміну вуглеводів, ліпідів, білків.

Актуальність теми: Оргнізм людини є відкрита сиитема, оскільки між ним і навколишним середовищем відбувається постійний обмін речовин, який включає процеси споживання, перетворення, використання і видалення продуктів обміну з організму. Обмін речовин – це сукупність всіх хімічних перетворень на молекулярному рівні, що протікають в клітинах тканин і направленні на самовідтворення їх структури та збереження стабільності внутрішнього середовища організму. Одночасно в організмі сбалансовано відбувається процеси розпаду (катаболізму) і синтезу (анаболізму). В процесах розпаду виділяється три основні етапи. В першій стадії продукти харчового раціону в шлунково-кишковому тракті білки, жири і вуглеводи, підвпливом ферментів розпадаються на структурні одиниці, втрачаючи свою видову специфічність. Білки – на амінокислоти; жири на гліцерин і жирні кислоти; вуглеводи на моносахариди. Після всмоктування в кров і поступлення в клітини, наступає ІІ –й етап, після чого ці молекулярні структури зазнають перетворень з утворенням для всіх спільного продукту ацетилкоензиму А. На третьому етапі ацетилКоА, поступаючи на внутрішню мембрану мітохондрій, в циклі трикарбонових кислот розпадається до СО₂ і Н₂О з виділенням відповідної кількості енергії для підтримки всіх життєвих функцій організму. В процесі анаболізму відбувається синтез специфічних для організму білків, жирів і вуглеводів з молекулярних структур, що всмоктались з кишечника та відповідних метаболітів, як продуктів проміжного обміну. Порушення даної закономірності приводить до розвитку патології.

Навчальні цілі:

Знати: як відбувається травлення білків, жирів, вуглеводів в шлунково-кишковому тракті під впливом ферментів відповідно до амінокислот, жирних кислот і гліцерину, моносахаридів та їх всмоктування в кров з послідуючим поступленням в клітини та перетворенням до кінцевих продуктів обміну.

Вмiти: визначати кислотність шлункового соку, вплив жовчі на активність ліпази, визначати концентрацію глюкози, кетонових тіл в крові та сечі давати клініко-діагностичну оцінку отриманим результатам.

Самостiйна позааудиторна робота:

1. Перечислити всі ферменти шлунково-кишкового тракту, що беруть участь в травленні білків, жирів, вуглеводів.
2. Вказати як відбуваються процеси утворення активних форм ферментів, що гідролізують білки і жири.
3. Назвати ферменти ШКТ, що гідролізують дисахариди на які молекулярні структури.
4. Назвати продукти та ферменти розщеплення глюкози в середині клітини анаеробним шляхом.
5. Написати реакцію розщеплення нейтрального жиру під впливом ліпази ШКТ до молекулярних структур.
6. Написати реакції процесу трансамінування амінокислот в клітинах під впливом специфічних ферментів.
7. Написати реакції окисного декарбоксилювання піровиноградної кислоти та назвати представників піруватдегідрогеназного комплексу.
8. Вказати регуляцію та патологію вуглеводного, жирового та білкового обміну.

Контрольнi питання:

1. Класифікація, властивості і функції основних груп вуглеводів.
2. Травлення та всмоктування вуглеводів харчового раціону, характеристика ферментів ШКТ.
3. Внутрішний розпад глюкози анаеробним та аеробним шляхом.
4. Регуляція та патологія вуглеводного обміну. Цукровий діабет та його ускладнення.
5. Класифікація, властивості і функції ліпідів.
6. Травлення та всмоктування продуктів гідролізу ліпідів в ШКТ. Роль жовчних кислот.
7. Ресинтез специфічних для організму жирів із продуктів гідролізу їх з харчового раціону.
8. Транспортні форми ліпідів крові.
9. Регуляція та порушення жирового обміну. Кетонові тіла. Молекулярний механізм розвитку атеросклерозу.
10. Класифікація та функція білків.
11. Травлення білків в ШКТ. Ферменти ШКТ, що приймають участь в гідролізі білків.
12. Шляхи використання амінокислот в клітинах. Дезамінування. Трансамінування.
13. Структура та функція нуклеїнових кислот.
14. Спадковість. Генетичний код. Генна інженерія.
15. Синтез білка. Компоненти, що приймають участь в синтезі білка. Етапи синтезу.
16. Інгібітори синтеза. Механізм дії антибіотиків на синтез білка.

Самостiйна робота на заняттi:

Виконати лабораторні роботи, оформити і захистити протокол.

1. Визначення вмісту глюкози в крові ортотулоїдиновим методом.

Принцип методу. Глюкоза при нагріванні з ортотолуїдином в розчині оцтової кислоти дає синьо-зелене забарвлення, інтенсивність якого прямо- пропорційна концентрації глюкози і визначається на фотоелектроколориметрі.

З ортотолуїдиновим реактивом реагують всі альдогексози, але їх вміст в крові невеликий, тому метод дозволяє визначити одну глюкозу.

Хід роботи. В дві центрифужні пробірки наливають по 0,9 мл 3% р-ну трихлороцтової кислоти, потім в одну з них вносять 0,1 мл крові, взятої з пальця (або сироватки крові), а в другу - 0,1 мл стандартного р-ну глюкози. Вміст пробірок перемішують і центрифугують при 3000 об/хв. Для визначення беруть по 0,5 мл надосадової рідини з кожної пробірки, вносять у звичайні сухі пробірки, добавляють по 4,5 мл ортотолуїдинового реактиву і поміщають пробірки в киплячу водяну баню, точно на 8 хвилин. Необхідно слідкувати, щоб вода в бані безперервно кипіла. Виймають пробірки і охолоджують водопровідною водою до кімнатної температури. Потім вимірюють на фотоелектроколориметрі оптичну густину проб в кюветах на 10 мм проти води при червоному світлофільтрі (620 нм).

Розрахунок. Вміст глюкози в дослідній пробі розраховують по стандартному р-ну глюкози за формулою:

С_ст х Е_досл

Сдосл =-----------------,

Е_ст

де С_досл - концентрація глюкози в крові в пробі, ммоль/л;

С_ст - концентрація глюкози в стандартній пробі, 10 ммоль/л;

Е_досл - оптична густина проби;

Е_ст - оптична густина стандарту глюкози.

Нормальний вміст глюкози в сироватці крові людини, що визначається ортотолуїдиновим методом, коливається в межах 3,33-5,55 ммоль/л (60-100 мг %).

Клінко-діагностичне значення

Підвищення вмісту глюкози в крові називається гіперглікемією. Фізіологічні гіперглікемії спостерігаються при емоційних стресах, споживанні великої кількості вуглеводів з їжею. Патологічні гіперглікемії найчастіше пов’язані з захворюванням ендокринної системи. Вони зустрічаються при цукровому діабеті, пухлинах кори наднирників та гіпофізу, гіперфункції щитовидної залози, тяжких розладах функції печінки, органічних ураженнях центральної нервової системи.

Гіпоглікемія (зниження рівня глюкози в крові) спостерігається при аденомах острівців підшлункової залози внаслідок підвищеного продукування інсуліну β-клітинами, недостатній функції щитовидної залози, наднирників, гіпофізу. Крім того, гіпоглікемія може бути викликана голодування, важкою фізичною працею, передозуванням інсуліну при лікуванні, порушенням всмоктування вуглеводів, захворюваннями нирок, які супроводжуються зниженням ниркового порогу для глюкози.

1. Якісне та кількісне визначення глюкози в сечі методом Альтгаузена.

Принцип методу. Метод базується на тому, що сеча, яка містить цукор при кип’ятінні з лугом набуває різних відтінків коричневого кольору (від жовтого до темно-бурого). Продуктами реакції є молочна кислота та гумінові речовини.

Хід роботи. 4-5мл сечі змішують у пробірці з 1мл 10% їдкого натрію або калію; кип’ятять 1 хв. і залишають на 10 хв. в штативі. При наявності цукру в сечі у пробірці утворюється один із відтнків стандартної шкали Альтгаузена.

Шкала Альтгаузена

Готують вихідний стандартний розчин. Для цього до сечі, яка не містить цукор, додають глюкозу з такого розрахунку, щоб її концентрація дорівнювала 4%. З цього розчину при розведенні сечі, яка не містить цукор, готують розчини різної концентрації за схемою:

№ про-бірки	Вихідний станд. розчин (мл)	Сеча, яка не містить цукор (мл)	Одержана концентрація цукру в сечі, %
	0,5	3,5	0,5
	1,0	3,0	1,0
	1,5	2,5	1,5
	2,0	2,0	2,0
	2,5	1,5	2,5
	3,0	1,0	3,0
	3,5	0,5	3,5

До всіх пробірок додають по 1 мл 10% р-ну лугу та кип’ятять.

Клініко-діагностичне значення

Якісне та кількісне визначення цукру в сечі має велике діагностичне та прогностичне значення. Глюкозурія може зустрічатися при цукровому діабеті, гострих запальних захворюваннях підшлункової залози, гіпертіреозі, акромегалії, синдромі Іценко-Кушінга, при захворюваннях печінки, внаслідок порушення синтезу глікогену, запальних процесах нирок, вагітності, надмірному вживанні вуглеводів з їжею.

1. Визначення холестерину в сироватці крові.

Якісне визначення холестерину

Принцип методу. Для виявлення холестерину застосовується ряд кольорових реакцій. Принцип їх полягає в тому, що холестерин в присутності водовіднімаючих засобів перетворюється з вторинного спирту в ненасичений вуглеводень.

Хід роботи.

а) Реакція з сірчаною кислотою (Сальковського)

В суху пробірку наливають 1 мл хлороформного розчину холестерину, нашаровують по стінці рівний об’єм концентрованої Н₂SО₄ і обережно збовтують. Після розшарування фаз спостерігається зміна: верхній (хлороформний) шар забарвлюється в пурпурно-червоний колір, нижній (шар кислоти) - в жовто-червоний колір із зеленуватою флуоресценцією.

б) Реакція з оцтовим ангідридом (Лібермана-Бурхарда)

В суху пробірку наливають 1-2 мл хлороформного розчину холестерину, додають 5-6 крапель оцтового ангідриду, 1-2 краплі концентрованої сірчаної кислоти, ретельно перемішують суміш скланою паличкою. Спостерігають за появою яскраво-зеленого кольору. При високій концентрації холестерину спочатку може спостерігатись рожево-червоне забарвлення, яке швидко переходить у синє і зелене.

2. Кількісне визначення холестерину в сироватці крові за методом Ілька

Принцип методу. Холестерин в присутності оцтового ангідриду і суміші оцтової і сірчаної кислот утворює сполуку зеленого кольору. Кількість холестерину визначають за інтенсивністю зеленого забарвлення методом колориметрії.

Хід роботи. Всі пробірки, піпетки, кювети повинні бути сухими. У дві пробірки наливають по 2,0 мл реактиву №1 (обережно) і додають: в першу пробірку - 0,1 мл розчину холестерину, в другу - 0,1 мл сироватки крові. Вміст пробірок перемішують струшуванням і ставлять в темне місце на 20 хвилин. Забарвлену в зелений колір рідину колориметрують на ФЕКу при червоному світлофільтрі (довжина хвилі 650-660 нм), в кюветах товщиною 5 мм проти води.

Розрахунок проводять за формулою:

Ед х Сст

Х = ------------,

Ест

де Х – вміст холестерину в досліджуваній сироватці в г/л;

Ед - оптична густина (екстинкція) досліджуваної проби;

Ест - оптична густина (екстинкція) стандартного розчину;

Сст - концентрація холестерину в стандартному розчині.

Коефіцієнт перерахунку в одиниці СІ (ммоль/л) дорівнює 0,0258.

Клініко-діагностичне значення

При розладі жирового обміну холестерин може нагромаджуватися в крові. Збільшення вмісту холестерину в крові (гіперхолестеринемія) спостерігається при атеросклерозі, цукровому діабеті, механічній жовтяниці, гіпотиреозі. Зниження холестерину в крові (гіпохолестеринемія) спостерігається при анеміях, голодуванні, туберкульозі, гіпертиреозі, раковому виснаженні, паренхіматозній жовтяниці, гарячкових станах, при введенні інсуліну.

4. Визначення кетонових тіл в сечі.

Проба Легаля на ацетон.

Принцип методу. Ацетон і ацетооцтова кислота з нітропрусидом натрію в лужному середовищі утворюють продукти реакції забарвлені в червоний колір. При додаванні крижаної оцтової кислоти утворюється комплексна сіль вишнево-червоного кольору.

Хід роботи. У дві пробірки наливають по 0,5 мл сечі: в першу - здорової людини (контроль), в другу - хворого на цукровий діабет. В обидві пробірки додають по 0,5 мл розчину їдкого натрію і по 5-7 крапель нітропрусиду натрію. Спостерігають за появою червоного забарвлення в другій пробірці (сеча хворого). Підкислюють розчин декількома краплями концентрованої оцтової кислоти. Червоне забарвлення набуває вишневого відтінку. Реакція Легаля малоспецифічна. Креатинін сечі при взаємодії з нітропрусидом натрію утворює аналогічне забарвлення, але в такому разі при додаванні концентрованої оцтової кислоти рідина не забарвлюється у вишневий колір.

Реакція Герхардта на ацетооцтову кислоту

Принцип методу. Принцип полягає в тому, що при додаванні до сечі розчину хлорного заліза випадає осад фосфатів (FeРО₄). При наявності ацетооцтової кислоти, після додавання надлишку хлорного заліза з’являється вишнево-червоне забарвлення. При стоянні розчину забарвлення блідне внаслідок декарбоксилювання ацетооцтової кислоти і перетворення її в ацетон. При нагріванні реакція проходить значно швидше.

Хід роботи. У дві пробірки наливають по 2 мл сечі (здорової людини і хворої на цукровий діабет), потім додають по краплях 10% розчин хлориду заліза до припинення утворення осаду фосфатів. Осад відфільтровують. До фільтрату додають ще кілька крапель FeCl₃ і спостерігають за появою вишневого забарвлення в пробірці з сечею хворого.

Клініко-діагностичне значення

Гіперкетонемія і кетонурія спостерігається при цукровому діабеті, споживанні кетогенної їжі (дефіцит вуглеводів), голодуванні, гіперпродукції гормонів (антагоністів інсуліну), кортикостероїдів, хворобі Гірке. Гіпокетонемія немає клінічного значення. При цукровому діабеті, коли в печінці знижений вміст глікогену, проходить посилений розпад жирів як джерела енергії. У результаті β-окислення нагромаджується ацетил-КоА. Це сприяє конценсації його з утворенням ацетоацетил-КоА, тим більше, що при цукровому діабеті може порушуватись протікання циклу Кребса і посилюватись нагромадження кетонових тіл. У ранньому дитячому віці тривалі шлунково-кишкові захворювання (дизентерія, токсикози) можуть викликати кетонемію в результаті голодування та виснаження.

5. Визначення кислотності шлункового соку.

Визначення вільної НС1

Принцип методу. Вміст вільної НС1 в шлунковому соці вимірюють в мл 0,1 н розчину NaOH, витраченого на нейтралізацію 1000 мл шлункового соку в присутності індикатора n-диметиламіноазобензолу (зона переходу рН 2,9-4,0; нижче 2,9 – рожево-червоний, вище 4,0 - жовтий). Вільна НС1 майже вся відтитровується при рН 3,0. При цьому забарвлення n-диметиламіноазобензолу змінюється з рожево-червоного до оранжевого.

Хід роботи. В колбочку відмірюють 5 мл профільтрованого шлункового соку, додають 1 краплю 0,5% р-ну n-диметиламіноазобензолу і титрують 0,1 н розчином їдкого натрію до появи оранжевого забарвлення.

Розрахунок. Якщо на титрування 5 мл шлункового соку витрачено 2 мл 0,1н розчину NaOH, то кількість вільної соляної кислоти дорівнює:

2 х 1000 х 0,1

Х = ------------------ = 40 ммол/л, де

2 – кількість 0,1 н розчину їдкого натрію, мл;

5 - кількість шлункового соку, яка взята для титрування, мл;

0,1 – кількість мг-екв лугу в 1 мл 0,1 н розчину;

1000 – перерахунок на 1 л.

Визначення зв’язаної НС1

Принцип методу. Визначення зв’язаної кислоти проводять таким чином: спочатку визначають загальну кислотність шлункового соку. Потім в присутності індикатора алізаринсульфоновокислого натрію (зона переходу рН 4,3-6,3; нижче 4,3 – жовтий, вище 6,3 - фіолетовий) - відтитровують усі кислореагуючі речовини, крім зв’язаної соляної кислоти. По різниці між загальною кислотністю і кислотністю, відтитрованою по алізарин-сульфоновокислому натрію розраховують кількість зв’язаної соляної кислоти.

Хід роботи. В окремій пробі визначають загальну кислотність шлункового соку (див. нижче), потім у колбочку наливають 5 мл досліджуваного шлункового соку, додають 1 - 2 краплі алізаринсульфоновокислого натрію і титрують 0,1 н розчином їдкого натрію до появи фіолетового забарвлення.

Розрахунок. Якщо на титрування загальної кислотності витрачено 5,0 мл 0,1 н р-ну NaOH, а на титрування з алізаринсульфоновокислим натрієм 4,0 мл, то кількість зв’язаної соляної кислоти дорівнює:

(А - В) х 1000 х 0,1

Х = ------------------------- = 20 ммоль/л, де

А – кількість 0,1 н р-ну NaOH, витраченого на титрування загальної кислотності, мл;

В - кількість 0,1 н розчину NaOH, витраченого на титрування суми всіх кислореагуючих речовин, мл;

5 - кількість шлункового соку, яка взята для титрування, мл;

0,1 - кількість мг/екв лугу в 1 мл 0,1 н р-ну;

1000 – перерахунок на 1 л.

Визначення загальної кислотності

Принцип методу. Загальну кислотність шлункового соку вимірюють в мл 0,1 н розчину їдкого натрію, витраченого на нейтралізацію 1000мл шлункового соку в присутності індикатора фенолфталеїну (зона переходу рН 8,3-10,0; нижче 8,2 – безбарвний, вище 10,0 - червоний).

Хід роботи. В колбочку відмірюють 5 мл шлункового соку, додають 1 краплю 0,5% р-ну фенолфталеїну і титрують 0,1 н розчином їдкого натрію до появи слаборожевого забарвлення, яке не зникає протягом 1 хвилини.

Розрахунок проводиться так, як і для вільної соляної кислоти.

Визначення загальної кислотності, загальної соляної кислоти, вільної соляної кислоти і зв’язаної соляної кислоти в одній порції шлункового соку

Принцип методу. Титрування 0,1 н розчином їдкого натрію проводять в присутності одночасно двох індикаторів n-диметиаміноазобензолу та фенолфталеїну.

Хід роботи. В колбочку відмірюють 5 мл профільтрованого шлункового соку, додають 1 краплю n-диметиламіноазобензолу і 2 краплі фенолфталеїну. При наявності в шлунковому соці вільної соляної кислоти він забарвлюється в червоний колір, при відсутності її відразу ж з’являється жовте забарвлення. Титрують вільну соляну кислоту 0,1 н розчином лугу з бюретки до появи оранжевого забарвлення і результат записують (1-а позначка). Не добавляючи лугу в бюретку, продовжують титрування до появи лимонно-жовтого кольору і результат записують (2-а позначка від нуля). Продовжують титрування до появи рожевого забарвлення (3-я позначка від нуля).

Розрахунок. 1-а позначка відповідає кількості вільної соляної кислоти (див. розрахунок), 2-а використовується для визначення зв’язаної соляної кислоти, а 3-я відповідає загальній кислотності. Середнє арифметичне між 2-ою і 3-ою позначками відповідає загальній соляній кислоті. Зв’язана соляна кислота визначається по різниці між вмістом загальної соляної кислоти і вільної.

Клініко-діагностичне значення

Визначення кислотності шлункового соку важливе для діагностики і правильного вибору методу лікування ряду захворювань шлунка і дванадцятипалої кишки. У хворих з дуоденальною виразкою, а також при гіперацидному гастриті відбувається збільшення вмісту вільної соляної кислоти (гіперхлоргідрія) і загальної кислотності (гіперацидітас). Зменшення кількості вільної соляної кислоти (гіпохлоргідрія) і загальної кислотності (гіпоацидітас) характерне для хронічного атрофічного гастриту. Гіпохлоргідрія, ахлоргідрія (повна відсутність соляної кислоти і пепсину) спостерігається у хворих раком шлунку.

Вміст вільної НС1 коливається від 20 до 40 ммоль/л. Зв’язана соляна кислота знаходиться в солеподібному стані з білками і продуктами їх травлення. В нормі вміст зв’язаної НС1 коливається від 10 до 20 ммоль / л. Загальна соляна кислота – сума вільної і зв’язаної соляної кислоти. Під загальною кислотністю шлункового соку розуміють суму всіх кислореагуючих речовин: вільна соляна кислота, зв’язана соляна кислота, кислі фосфати, молочна кислота та ін. В нормі загальна кислотність в дорослої людини коливається в межах 40-60 ммоль/л.

6. Визначення активності амінотрансферази АлАТ, АсАТ.

Принцип методу. В результаті переамінування під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ) аспарагінова кислота перетворюється в щавелевооцтову (ЩОК), а аланін під дією аланінамінотрансферази (АлАТ) - в піровиноградну кислоту (ПВК). ЩОК здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в ПВК. При додаванні кислого 2,4-динітрофенілгідразину (2,4-ДФГ) ферментативний процес зупиняється і утворюється динітрофенілгідразин піровиноградної кислоти, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної ПВК. Таким чином, по кількості утвореної ПВК можна судити про активність ферменту. Активність амінотрансфераз виражають в мікромолях ПВК, утвореної 1 мл сироватки крові за 1 годину інкубації при температурі 37^оС. В нормі активність АсАТ сироватки крові становить 0,1-0,45 мкмоль/год х мл, а АлАТ - 0,1-0,68 мкмоль/год х мл. м

Хід роботи.

1. Визначення активності аспартатамінотрансферази

В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл субстратної суміші для визначення АсАТ і ставлять в термостат при 37^оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0,1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0,1 мл води і 0,5 мл р-ну 2,4-ДФГ. Ставлять обидві пробірки в термостат на 60 хвилин при температурі 37^оС. Виймають пробірки, додають в дослідну пробу 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ і залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Далі додають по 5 мл 0,4 н розчину NаОН в кожну пробірку, ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на ФЕКу в кюветі на 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-560 нм) проти контролю.

Розрахунок активності ферменту виконують по приготовленому заздалегідь калібрувальному графіку (за допомогою стандартного розчину ПВК). Активність виражають в умовних одиницях з розрахунук на 1 мл сироватки. 1 одиниця АсАТ відповідає такій активності ферменту, яка здатна за даних умов утворювати 1 мкг ПВК. При обчисленні ферменту необхідно врахувати і розведення сироватки:

Х = А х 10, де

Х – одиниця активності ферменту;

10 - пеперахунок на 1 мл;

А - кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг.

У сироватці крові здорових людей активність АсАТ, визначена при допомозі даного методу, коливається від 8 до 40 од. Перерахунок активності ферменту в мікромолі ПВК, що утворилася при інкубації 1 мл сироватки протягом 1 години при 37^оС, проводять за формулою:

А х 10

АсАТ = ---------, де

А – кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг;

88 - маса 1 мкмоль ПВК, мкг;

10 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки.

2. Визначення активності аланінамінотрансферази

В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл субстратної суміші для АлАТ і ставлять у водяну баню або термостат при 37^оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0,1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0,1 мл і 0,5 мл р-ну 2,4-ДФГ і інкубують обидві пробірки в термостаті або водяній бані при 37^оС протягом 30 хвилин. Виймають пробірки з термостата, додають в дослідну пробу 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ і обидві пробірки залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі. Потім додають по 5 мл 0,1н розчину NaOH в кожну пробірку, ретельно перемішують, залишають при кімнатній температурі на 10 хвилин і фотометрують так, як описано вище.

Розрахунок виконується за готовою калібрувальною кривою. Для розрахунку активності АлАТ і перерахунку її в мікромолі ПВК використовують ті ж формули, що і для АсАТ (результат перемножують на 2 - коефіцієнт перерахунку на 1 годину інкубації). В сироватці крові здорових людей активність АлАТ, визначена за допомогою даного методу, коливається в межах 5-30 одиниць.

Клініко-діагностичне значення

АлАТ і АсАТ зарекомендували себе як найбільш чутливі індикатори пошкодження паренхіми печінки (особливо АлАТ). Активність АлАТ, що перевищує в 10 і більше разів верхню межу норми, спостерігається переважно при гострих гепатитах (вірусному і токсичному), підвищення активності ферменту в 5-10 разів характерне для гострих (вірусного, алкогольного, медикаментозного) гепатитів, загострення хронічного активного гепатиту і пухлин печінки. Показники, що перевищують нормальні в 1,5-5 разів, спостерігаються при всіх перерахованих вище захворюваннях, а також в перший тиждень гострої обтурації загального жовчного протоку.

Активність АсАТ змінюється подібно до АлАТ, але з меншими потенційними можливостями (менша частота виявлення і більш низький рівень зміни активності).

Визначення активності амінотрансфераз в сироватці крові має виключно важливе значення для діагностики захворювань серця. В початковому періоді інфаркту міокарда через 4-6 годин спостерігається підвищення активності АсАТ, через 24-36 годин воно чітко виражене і лише на 3-7 день активність ферменту знижується до норми. Зміни АлАТ при цьому невеликі.

Лiтература.

1. Конспект лекцій.
2. Биологическая химия /Воронина Л.Н. и др.- Х.:Основа, 1999.
3. Губський Ю.I. Бiологiчна хiмiя. – Київ-Тернопiль: Укрмедкнига, 2000
4. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.:Медицина, 1999.
5. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. – Біохімія людини, 2000.

Заняття № 6

Тема:Тканинне дихання і окисне фосфорилювання.

Актуальність теми: Енергетичні потреби організму забезпечуються за рахунок енергії, яка вивільняється у процесі тканинного дихання. Порушення цього процесу внаслідок цілого ряду причин зумовлює гіпоенергетичний стан, що є одним із патогенетичних механізмів багатьох хвороб. Фармакологічна дія багатьох лікувальних препаратів проявляється у змінах біоенергетичних процесів, спряжені чи роз'єднанні тканинного дихання і синтезу АТФ.

Окисне фосфорилювання – синтез АТФ за рахунок енергії, що вивільняється в процесі переносу електронів і протонів по дихальному ланцюгу – основний механізм депонування енергії в аеробних організмах. Порушення спряження тканинного дихання і окисного фосфорилювання призводить до зниження енерго-забезпечення клітин та розвитку патології. Ряд токсичних речовин та лікувальних препаратів впливають на ці процеси.

Навчальні цілі:

Знати: Структури компонентів дихального ланцюга, його послідовність механізму переносу електронів і протонів. Пояснити механізми спряження тканинного дихання і окисного фосфорилювання в мітохондріях. Розуміти процеси мікросомального і вільно-радикального окислення.

Вмiти: Визначати активність ферментів тканинного дихання, давати клініко-діагностичну оцінку отриманим результатам.

Самостiйна позааудиторна робота:

1. Записати схему дихального ланцюга та показати пункти спряження із синтезом АТФ.
2. Вказати на схемі місця дії інгібіторів тканинного дихання та пояснити механізм дії роз'єднувачів тканинного дихання окисного фосфорилювання.
3. Написати формулу АТФ, НАД, ФАД, КоQ.
4. Викласти суть теорії Д.Мітчелла. Зобразити схему утворення електрохімічного потенціалу в мітохондріях та дію АТФ-синтетези.
5. Написати і пояснити схему мікросомального окислення.
6. Підготувати вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи.

Контрольнi питання:

1. Історія розвитку вчення про біологічне окислення.
2. Сучасні явлення про механізм тканинного дихання.
3. Будова і механізм дії компонентів дихального ланцюга.
4. Структура нікотинамідних та флавінових дегідрогеназ, убіхінону та цитохромів.
5. Спряження дихання і окисного фосфорилювання.
6. Основні положення хеміосмотичної теорії механізму окисного фосфорилювання.
7. Інгібітори тканинного дихання та інгібітори нікотиамідних і флавінових дегідрогеназ. Їх використання як фармпрепарати.
8. Мікросомальне окислення. Значення його.
9. Вільнорадикальне окислення. Прооксидантна та антиоксидантна системи організму.

Самостiйна робота на заняттi:

Виконати лабораторні роботи, оформити і захистити протокол.

1. Визначення активності сукцинатдегідрогенази мітохондрій.

Сукцинатдегідрогеназа м’язів - це залізофлавопротеїн, що каталізує окислення (дегідрування) янтарної кислоти у фумарову. Коферментом сукцинатдегідрогенази служить флавінаденіндинуклеотид (ФАД). Активність ферменту залежить від наявності в ньому вільних сульфгідрильних груп та атомів заліза.

Як джерело ферменту використовується відмита м’язева тканина. Дію цього ферменту можна виявити при додаванні до янтарної кислоти метиленової синьки або 2,6-дихлорфеноліндофенолу (синього кольору), які виступають в якості акцептора водню і, відновлюючись, перетворюються у безбарвну форму.

Принцип методу. Метод грунтується на виявленні знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу в реакції з янтарною кислотою в присутності м’язів як джерела ферменту сукцинатдегідрогенази. Конкурентне гальмування активності цього ферменту викликає малонова кислота НООС-СН₂-СООН, яка є структурним аналогом янтарної кислоти.

Хід роботи. Свіжу м’язеву тканину (1 г) подрібнюють ножицями і розтирають в ступці з невеликою кількістю води (2-3 мл) протягом 1 хв. Одержаний гомогенат переносять на подвійний шар марлі, розміщеної на лійці, промивають водою, ставлять на фільтрувальний папір і висушують.

В три пробірки наливають по 3 мл фосфатного буферу (рН 7,4) і поміщають в них по 0,1г м’язевого гомогенату. Потім в дослідну пробірку додають 5 крапель 3% р-ну янтарної кислоти і для нейтралізації 5 крапель 0,1н р-ну їдкого натрію, а в контрольну - 10 крапель дистильованої води. В третю пробірку додають 5 крапель 3% р-ну малонової кислоти, 5 крапель 3% р-ну янтарної кислоти і 5 крапель 0,1н р-ну їдкого натрію. У всі пробірки доливають по 1 мл 0,001 н р-ну дихлорфеноліндофенолу і вміст їх добре перемішують. Проби ставлять в термостат при 37^оС на 40 хв. Відмічають знебарвлення вмісту в першій пробірці і порівнюють її з контролем і пробіркою, де знаходився конкурентний інгібітор сукцинатдегідрогенази - малонова кислота. Час знебарвлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу в присутності янтарної кислоти характеризує активність сукцинатдегідрогенази.

1. Визначення активності каталази крові.

Фермент каталаза (Н₂О₂ - оксидоредуктаза) знаходиться у великій кількості в еритроцитах та печінці і розкладає перекис водню з утворенням кисню та води.

каталаза

2Н₂О₂ ---------> О₂+2Н₂О

Принцип методу. Активність каталази крові вимірюють за кількістю перекису водню, розкладеного каталазою, або кількістю кисню, який виділився при цій реакції. Активність каталази виражають за допомогою каталазного числа і показника каталази.

Каталазним числом називається кількість міліграмів перекису водню, яка розкладається 1 мкл крові.

2КМnO₄+5H₂O₂+3H₂SO₄ = К₂SO₄+2MnSO₄+8H₂O+5O₂

Кількість розщепленого перекису водню оцінюють за різницею кількості КMnО₄, використаного на титрування до і після дії каталази.

Показником каталази називають дріб, в якому числівником являється каталазне число, а знаменником число мільйонів еритроцитів в 1 мкл досліджуваної крові.

При кількісному визначенні активності каталази потрібно зрівнювати показники каталази, а не каталазні числа, так як фермент знаходиться майже виключно в еритроцитах.

Хід роботи. Розведену кров (1:1000) збовтують та наливають по 1 мл у дві колби, доливають по 7 мл дистильованої води. У дослідну пробу доливають 2 мл 1% Н₂О₂, а в контрольну - 5 мл 10% р-ну сірчаної кислоти. Дія каталази в кислому середовищі припиняється (в контрольній пробі), оскільки вона діє при рН 7,4. Колби залишають при кімнатній температурі на 30 хв. Потім доливають у дослідну колбу 5 мл 10% р-ну Н₂SO₄, а в контрольну - 2 мл 1% р-ну Н₂О₂. Вміст кожної колби титрують 0,1н розчином КMnО₄ до рожевого забарвлення. Розраховують каталазне число (КЧ) за формулою:

КЧ= (А-В) х 1,7

де А – кількість 0,1н р-ну КМnО₄, яка пішла на титрування контрольної проби, мл;

В - кількість 0,1н р-ну КМnО₄, яка пішла на титрування дослідної проби, мл.

Одержану різницю перемножують на 1,7 і отримують каталазне число для досліджуваної крові.

Примітка. 1 моль/л Н₂О₂ = 17 г, а в 1 мл 0,1н розчину міститься 1,7 моль/л (1,7 мг) Н₂О₂. 1 мл 0,1н р-ну КМnО₄ еквівалентний 1 мл 0,1н Н₂О₂. Перемножуючи 1,7 на різницю між кількістю мл 0,1 н р-ну КМnО₄, що пішла на титрування контрольної та дослідної проб, отримують кількість мг Н₂О₂ яка розкладається 1 мкл досліджуваної проби, тобто каталазне число.

Клініко-діагностичне значення

Активність каталази крові знижується при анемії, туберкульозі, ракових захворюваннях.

Лiтература.

1. Конспект лекцій.
2. Биологическая химия /Воронина Л.Н. и др.- Х.:Основа, 1999.
3. Губський Ю.I. Бiологiчна хiмiя. – Київ-Тернопiль: Укрмедкнига, 2000
4. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.:Медицина, 1999.
5. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. – Біохімія людини, 2000.

Заняття № 7

Тема: Біохімія крові і сечі.

Актуальність теми: Кров – спеціалізована рідка тканина, яка поєднує метаболічні процеси різних частин тіла в цілісну систему та підтримує постійність її складу. Біохімічний аналіз крові та сечі широко застосовується для діагностики захворювань і контролю ефективності лікування. Тому розуміння функції як крові так і нирок дає важливу інформацію про стан стабільності гомеостазу організму.

Навчальні цілі:

Знати: Основні функції крові та нирок, фізико-хімічні властивості та хімічний склад крові та сечі в нормі та за умов патології. Знати лікарські препарати, що отримати із крові.

Вмiти: Визначати вміст білка і його фракцій сироватки крові, а також визначати патологічні компоненти сечі.

Самостiйна позааудиторна робота:

1. Скласти таблицю „Найважливіші біохімічні показники крові та сечі”, використовуючи таблиці із підручників та посібників з біохімії.
2. Перерахувати патологічні компоненти сечі та вказати причини їх появи.
3. Підготувати вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи.

Контрольнi питання:

1. Основні функції крові.
2. Фізико-хімічні властивості крові. Буферні системи крові та механізми їх дії.
3. Білковий склад крові. Гіпо-, гіпер, дис-, і парапротеїнемії.
4. Ферменти сироватки крові, їх походження і характеристика індикаторних, секреторних та інкреторних ферментів. Діагностичне значення аналізу активності ферментів крові.
5. Небілкові азотисті та безазотисті компоненти крові.
6. Згортання крові. Фармпрепарати: антикоагулянти і тромболітики.
7. Кров як джерело лікарських препаратів.
8. Функціональна біохімія нирок.
9. Роль нирок у регуляції і водно-сольовому обміні і кров'яному тиску. Ренін – ангіотензин-альдостеронова система.
10. Механізм утворення сечі. Процеси фільтрації, реабсорбції та секреції.
11. Хімічний склад сечі в нормі та при патології.
12. Клініко-діагностичне значення біохімічного дослідження крові і сечі.

Самостiйна робота на заняттi:

1. Визначення вмісту білка в сироватці крові біуретовим та рефрактометричним методами.
2. Кожний студент індивідуально аналізує окрему пробу сечі, офрмлює і захищає протокол.

Об'єм досліджень:

1) фізико-хімічні властивості – колір, відносна густина, прозорість, запах, реакція (рН);

2) якісні реакції на білок, глюкозу, кетонові тіла, кров'яні пігменти;

3) кількісне визначення глюкози і білка.

1. Визначення вмісту білка біуретовим методом.

Принцип методу. Вимірювання інтенсивності забарвлення, яке утворюється при взаємодії пептидних зв’язків білка з сульфатом міді в лужному середовищі. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації білка і визначається за допомогою фотоелектроколориметра.

Хід роботи. В першу пробірку наливають 0,1 мл сироватки крові, в другу - 0,1 мл стандартного розчину білка; в третю - 0,1 м 0,9% розчину хлориду натрію (контроль). У всі пробірки наливають по 5 мл біуретового реактиву, перемішують і через 30 хвилин визначають екстинкцію за допомогою ФЕКа в кюветах 10 мм при червоному світлофільтрі (750 нм) контрольного розчину.

Розрахунок проводять за формулою:

А х В

Х = ---------, де

Дата добавления: 2014-11-18