Методы индикации вирусов

Для индикации или обнаружения вирусов используют:

1. Цитопатическое действие вирусов (ЦПД).

2. Метод негативных колоний.

3. Реакция гемадсорбции (ГА).

4. Реакция гемагглютинации (РГА)

После получения монослоя жизнеспособных культур клеток их заражают материалом, который содержит вирусы. Цитопатическое действие (ЦПД) характеризуется морфологическими изменениями клеток. Часть из таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате, вместо сплошного монослоя клеток остаются лишь отдельные клеточные островки, которые обнаруживаются микроскопически. Характер ЦПД, вызваного разными вирусами неодинаков. Например, при поражении парамиксовирусами, герпесвирусами наблюдается слияние клеток с образованием синцития, при энтеровирусах, реовирусах – сморщивание и деструкция клеток, при аденовирусах – гроздевидная агрегация клеток, при поражении вирусом кори – симпластобразование. То есть, характер ЦПД используют для ориентировочной идентификации.

Определение вирусных частиц методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают 10-ти кратными разведениями вируса. После инкубации в 6-7 дней их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50% зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз

(ЦПД ₅₀) в 1 мл препарата.

ЦПД, кроме микроскопирования, может быть обнаружено методом негативных колоний или методом бляшек. Суть этого метода заключается в следующем: монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара с индикатором нейтральным красным. Агар в этом случае используют для того, чтобы ограничить распространение вируса по клеточному слою. Инкубируют при 37 ⁰С и через 48-96 часов выявляют пятна бляшки или негативные колонии. Живые клетки накапливают краску, погибшие –ее теряют, поэтому участки клеточного монослоя, поврежденные вирусом, выглядят светлыми на фоне окрашенных клеток. Обычно бляшки имеют диаметр 1-3 мм. Пятна возникают за счет ЦПД вируса.

Наиболее точным количественным методом учета вирусных частиц является метод бляшек. Зависимость между числом образовавшихся бляшек и числом инфекционных вирусных частиц в препарате строго линейна, и, следовательно, каждая негативная колония соответствует одной инфекционной единице. Конечный результат титрования или титр вируса выражается количеством бляшкообразующих единиц –БОЕ.

Титр рассчитывают:

а

Титр вируса (БОЕ / мл) == --------------------------

Дата добавления: 2014-12-10