Контактные методики

Краткая характеристика основных методов СЗМ применяемых в биологических исследованиях на СЗМ Solver BIO и NTEGRA vita.

Цели и задачи изучения темы

Тема 4.2 Методы сканирующей зондовой микроскопии

Вопросы для повторения

1. Дайте краткую характеристику АСМ.

2. Какой принцип работы оптической системы АСМ.

3. Как происходит сканирование поверхности образца.

4. Для чего нужен кантилевер.

5. Какие биологические объекты можно изучать в АСМ.

Цель: формирование знаний об основных методах сканирующей зондовой микроскопии.

Задачи:

· изучение сущности методов работы атомно-силовых микроскопов;

· оценка возможности использования методов для изучения биологических объектов.

Все методы получения информации о рельефе и свойствах поверхности с помощью АСМ можно разбить на две большие группы – контактные квазистатические и бесконтактные колебательные. В зависимости от расстояния зонд – образец при сканировании различают три метода работы атомно-силового микроскопа: 1) контактный, 2) бесконтактный, 3) «полуконтактный», который является промежуточным между контактным и бесконтактным.

В контактном методе острие зонда непосредственно соприкасается с поверхностью образца в процессе сканирования. В бесконтактном методе зонд находится достаточно далеко и не касается поверхности. Полуконтактный метод подразумевает частичный контакт. Последние два метода работы АСМ необходимы для реализации модуляционных (или колебательных) методик. Каждый метод предназначается для решения определенного ряда задач. Например, существует три метода измерения рельефа с помощью АСМ:

· контактная атомно-силовая микроскопия — измерение топографии поверхности в контактном методе.

· бесконтактная атомно-силовая микроскопия — измерение топографии поверхности в бесконтактном методе, основанном на использовании вибрационной методики.

· «полуконтактная» атомно-силовая микроскопия (или прерывисто-контактная атомно-силовая микроскопия) — в данном случае используется вибрационная методика, при которой колеблющееся острие слегка стучит по поверхности образца.

1.1. Метод постоянной высоты. При использовании этого метода сканер микроскопа поддерживает закрепленный конец кантилевера на постоянной высоте. Таким образом, отклонения кантилевера отражают рельеф поверхности исследуемого образца. Основным достоинством метода постоянной высоты является высокая скорость сканирования, однако поверхность образцов должна быть гладкой.

1.2. Метод постоянной силы. При использовании метода постоянной силы величина изгиба кантилевера поддерживается в процессе сканирования постоянной при помощи системы обратной связи.

Таким образом, вертикальные смещения сканера отражают рельеф поверхности исследуемого образца. Основное достоинство метода постоянной силы является возможность проводить измерения других характеристик – сил трения, сопротивления, растекания и др. Однако при исследовании относительно мягких биоматериалов такой режим работы может разрушить (процарапать) образец, поскольку зонд в процессе сканирования находится в непосредственном контакте с поверхностью исследуемого образца. При исследовании относительно мягких неоднородных биоматериалов локальный прогиб поверхности образца меняется в процессе сканирования, что тоже может привести к искажениям получаемого рельефа поверхности. Возможное наличие существенных капиллярных сил, обусловленных наличием слоя воды, также приводит к ухудшению разрешения.

1.3. Метод рассогласования. Сигнал рассогласования системы обратной связи, возникающий в процессе сканирования с использованием метода постоянной силы содержит дополнительную информацию относительно рельефа поверхности. Он может быть использован для более полного воспроизведения рельефа. Может рассматриваться как промежуточный между методом постоянной силы и методом постоянной высоты, если коэффициент усиления системы обратной связи (т.е. скорость отработки сигнала рассогласования) устанавливается таким, чтобы система была способна отрабатывать относительно гладкие особенности рельефа и в то же время быть достаточно медленной, чтобы отрабатывать крутые ступеньки. В результате сигнал рассогласования будет плохо отображать гладкие особенности рельефа и с высоким контрастом отображать резкие шероховатости. Такой способ отображения может быть полезным для поиска небольших неоднородностей на большом относительно гладком фоне.

Рис. 56. Сканирование с использованием метода рассогласования.

Необходимым условием реализации является предварительная настройка прибора для работы по методу постоянной силы. После настройки прибора и получения рельефа поверхности по методу постоянной силы можно переходить к работе с использованием контактного метода рассогласования.

1.4. Метод отображения сопротивления растекания.Для работы этим методом необходим проводящий зонд ССМ находящийся в непосредственном контакте с поверхностью образца. К зонду прикладывается напряжение смещение и проводятся измерения результирующего тока через образец в зависимости от положения зонда одновременно с получением данных о рельефе по методу постоянной силы. Так, при заданном смещении величина измеряемого тока пропорциональна локальному сопротивлению исследуемого образца.

Рис 57. Сканирование с использованием метода отображения сопротивления растекания.

1.5. Метод латеральных сил. Позволяет различать области с различными коэффициентами трения, а также подчеркивать особенности рельефа поверхности. Эти возможности могут быть использованы одновременно с получением рельефа поверхности для более полной характеризации исследуемого образца.

При сканировании по методу постоянной сила перпендикулярно продольной оси кантилевера помимо изгиба кантилевера в нормальном направлении происходит также и его торсионный изгиб. Он обусловлен моментом силы действующей на зонд. Для малых отклонений угол закручивания пропорционален поперечной (латеральной) силе. Торсионное закручивание кантилевера измеряется оптической следящей системой микроскопа. При сканировании гладкой поверхности с участками с различными коэффициентами трения угол скручивания меняется на каждом участке. Это позволяет проводить измерения локальной силы трения. Если же поверхность не гладкая, то такая интерпретация затруднена. Для того, чтобы различить участки с различными коэффициентами трения и неоднородности рельефа необходимо использовать второй проход в противоположном направлении. Кроме того измерения латеральных сил позволяют относительно просто достигать атомарное разрешение на слюде и на других слоистых материалах.

2. Динамические контактные методы.

2.1. Метод модуляции силы. В процессе реализации метода модуляции силы одновременно со сканированием образца, в соответствии с методом постоянной силы, сканер (или образец) совершает вертикальные периодические колебания. В ходе сканирования кантилевер «чувствует» поверхность образца. При этом давление зонда на поверхность образца не остается постоянной, но содержит периодическую (обычно синусоидальную) компоненту.

Рис. 58. Сканирование с использованием метода модуляции силы.

В соответствии с локальной жесткостью образца величина соответствующих вмятин будет изменяться в процессе сканирования. На жестких участках поверхности образца вмятины будут мельче, а на мягких участках – глубже. Отслеживание рельефа поверхности образца проводится с использованием усредненного изгиба кантилевера в системе обратной связи.

Если известны величины вертикального смещения сканера Dz, вертикального смещения зонда D и жесткость кантилевера к_s , то можно определить локальную жесткость исследуемого образца к_s

к_s = к_с· (Dz/D - 1)

В свою очередь при известной локальной жесткости можно определить модуль упругости образца.

2.2. Метод Отображения Фазы. Когда в процессе колебаний кончик зонда касается поверхности образца он испытывает не только отталкивающие, но и адгезионные, капиллярные и ряд других сил. В результате взаимодействия зонда с поверхностью образца происходит сдвиг не только частоты, но и фазы колебаний. Если поверхность образца является неоднородной по свои свойствам, соответствующим будет и фазовый сдвиг. Распределение фазового сдвига по поверхности будет отражать распределение характеристик материала образца. Такой метод сканирования, при котором регистрируется фазовый сдвиг (Метод Отображения Фазы) является весьма полезным для исследований материалов. Метод отображения фазы позволяет получать ценную информацию в широкой области применений, в некоторых случаях отображая неочевидные контрасты свойств материалов.

Рис. 59. Сканирование с использованием метода отображения фазы.

2.3. Отображение адгезионных сил. Соответствующая отводу зонда часть силовой кривой зачастую соответствует кривой подвода, однако чаще наблюдается гистерезис. Наиболее часто тип гистерезиса соответствует определенному виду адгезии, которая проявляется в силовой кривой как изгиб вниз от исходного равновесного состояния. Источник адгезии может варьироваться в зависимости от образца. В идеальном случае взаимодействующей с плоской поверхностью сферы сила адгезии может быть соотнесена с радиусом сферы и поверхностной энергией обеих поверхностей. В обычных условиях основной источник адгезии связан с формированием капиллярного «мостика» между зондом и образцом. В воздушной атмосфере большинство образцов покрыты адсорбционным слоем воды толщиной в несколько нм, этот водный слой смачивает кончик зонда и формирует «мостик» между зондом и образцом. Для разрыва этого мостика требуется существенная сила, обусловленная преодолением поверхностного натяжения. В жидкости сила адгезии зависит от межфазной поверхностной энергии между зондом и образцом и раствором. Изменения раствора приводят к изменению силы адгезии. Другая форма «адгезии» возникает в случае, если различные виды «адгезии» возникают, когда полимер захвачен между АСМ зондом и подложкой. При этом регистрируются очень отличающиеся «адгезионные» силы, вызванные отрывом зонда. Обычно эти кривые в начале повторяют кривые подвода вблизи поверхности, однако вдали от поверхности представляют пологий отрицательный изгиб, когда полимер растягивается, пока он не порвется или не оторвется от зонда или подложки, и кантилевер вернется к неизогнутому состоянию. Если несколько молекул полимера прикреплены к зонду и подложке, то может наблюдаться пилообразная картина отрыва индивидуальных молекул. Чтобы быть полезными, силовые кривые должны быть представлены как зависимости силы от расстояния, F(D). Однако общеупотребительные АСМ не обладают возможностью независимого определения D. Вместо этого зависимость от D строится путем вычитания отклонения зонда из z-перемещения сканера. В некоторых случаях отрыв зонда при обратном движении сканера оказывается резким, и соответствующая сила (сила адгезии) может быть измерена относительно точно. Соответствующие адгезионные карты обычно строятся выбором наибольшей отрицательной силы детектируемой на кривой отвода в качестве силы адгезии и нанесением этих значений на x–y точку снятия каждой кривой. Могут быть получены несколько типов адгезионных карт. Используя специальные АСМ зонды, модифицированные антителами или лигандами, можно строить карту распределения специфических протеинов на поверхности живых клеток и т.д.

3. Полуконтактные методы. Относительно слабый сдвиг частоты колебаний под влиянием отталкивающих сил означает, что контакт зонда с поверхностью образца в процессе колебаний не является постоянным. Только в течение короткой части периода колебаний зонд «ощущает» контактные отталкивающие силы. Особенно это касается колебаний с большой амплитудой. Сканирование поверхности образца с колеблющимся кантилевером является не бесконтактным, а скорее прерывисто-контактным. Соответствующий метод Сканирующей Зондовой Микроскопии (прерывисто-контактный метод, ПКМ) довольно часто используется на практике. Прерывисто-контактный метод обладает определенными преимуществами по сравнению контактными методами. Прежде всего, при использовании этого метода давление кантилевера на поверхность образца существенно меньше, что позволяет работать с более мягкими и легко разрушающимися материалами, такими как полимеры и биоматериалы. Прерывисто-контактный метод также более чувствителен к различным взаимодействиям с поверхностью, что дает возможность ряда характеристик поверхности – распределение вязкости и упругости, электрических и магнитных доменов.

4. Бесконтактные методы. Бесконтактная ССМ (БК ССМ), обладает уникальными возможностями по сравнению другими методами зондовой микроскопии. Отсутствие сил отталкивания (присутствующих в Контактной ССМ) в БК ССМ позволяет использовать ее в исследованиях «мягких образцов», при этом в БК ССМ, в отличие от СТМ, не требуется наличие проводящих образцов. БК ССМ использует принцип определения «модуляции амплитуды». Соответствующая измерительная схема использует изменения амплитуды колебаний кантилевера (A), обусловленные взаимодействием зонда с образцом. Работа по методу БК ССМ может быть описана в терминах градиентно-силовой модели. В соответствии с этой моделью в пределе малых (A) при приближении кантилевера к образцу резонансная частота кантилевера f_o сдвигается на величину df к своему новому значению в соответствии с выражением

f_{eff =}f_o (1- F ’(z)/k_o)^1/2

где f_eff есть новое значение резонансной частоты кантилевера с номинальной величиной жесткости k_o, а F’(z) - градиента силы взаимодействия кантилевера с образцом. Величина z представляет эффективный зазор зонд-образец, для случая сил притяжения величина df = f_eff - f_o отрицательна.

Если возбуждающая частота колебаний кантилевера f_set >f_o, то сдвиг резонансной частоты в сторону меньших значений приводит к уменьшению амплитуды колебаний f_set кантилевера с частотой f_set при приближении к образцу. Эти изменения амплитуды A используются в качестве входного сигнала в системе обратной связи. Для получения сканированного изображения по методу БК ССМ необходимо, прежде всего, выбрать некую амплитуду A _set в качестве уставки, при этом A _set < A (f_set) когда кантилевер находится вдали от поверхности образца. Система обратной связи подводит кантилевер поближе к поверхности, пока его мгновенная амплитуда A не станет равной амплитуде A _set при заданной частоте возбуждения колебаний f_set. Начиная с этой точки может начаться сканирование образца в x – y плоскости с удержанием системой обратной связи A = A _set = constant для получения БК ССМ изображения. Система обратной связи подводит кантилевер ближе к образцу (в среднем) если A _set уменьшается в какой-либо точке, и отодвигает кантилевер от образца (в среднем) если A _set увеличивается. В целом, как следствие вышеизложенной модели в пределе малых A сканированное изображение может рассматриваться как рельеф постоянного градиента силы взаимодействия зонд-образец.

Метод БК ССМ обладает тем преимуществом, что зонд не контактирует с образцом и поэтому не разрушает его и не искажает его изображения. В частности, это может быть важным при исследовании биологических образцов.

Рис. 60. Сканирование с использованием бесконтактного метода.

5. АСМ динамическая литография. СЗМ позволяет осуществлять непосредственное силовое воздействие зондом на поверхность образца. Это может производиться двумя путями – статическим воздействием (Наногравировка) и динамическим воздействием (Наночеканка). При Наногравировке используется Контактный метод сканирования для формирования рисунка на поверхности подложки или на нанесенном на нее слое, например, слое резиста, с последующим использованием его в качестве маски травления. Такая технология нанолитографии достаточно проста и дешева, однако у нее есть определенные недостатки. При формировании наноканавки статическим воздействием зонда случайные торсионные изгибы кантилевера приводят к краевым неоднородностям рисунка. Кроме того, предварительное и последующее после нанолитографической операции сканирования приводят к сдвиговым искажениями рисунка.

С использованием АСМ Динамической Литографии (Наночеканки) модификация поверхности происходит за счет формирования углублений на поверхности образца колеблющимся зондом, при этом используется прерывисто-контактный метод сканирования. Такой метод нанолитографии свободен от сдвиговых искажающих воздействий, решает проблему торсионных искажений и позволяет производить визуализацию сформированного рисунка без серьезного воздействия на поверхность подложки или резиста.

АСМ Динамическая Литография может производиться с использованием векторного или растрового сканирования. Векторная литография осуществляется по заранее заданному рисунку, ее преимущество заключается в относительно большой скорости, однако она не позволяет варьировать силу воздействия на подложку в процессе литографии. Растровая литография осуществляется более медленно, поскольку при ее проведение сканирование осуществляется по всей площади участка подложки, на которой формируется рисунок, однако она позволяет осуществлять различное (в зависимости от рисунка шаблона) по силе воздействие зонда на подложку.

Дата добавления: 2014-11-29