Вопросы для повторения. 1. Что необходимо учитывать при подготовке образцов для исследования методом спектрального рентгеновского микроанализа

1. Что необходимо учитывать при подготовке образцов для исследования методом спектрального рентгеновского микроанализа.

2. Дайте характеристику методам препарирования образцов для подготовки к спектральному рентгеновскому микроанализу.

Приложение 3. Исследование морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи рентгеновского микроанализа

***

Методом электронно-зондового микроанализа определена концентрация элементов (К, Na, C1) в миоците криосрезов папиллярной мышцы изолированного сердца крысы.

Исследования проведены на изолированном сердце крыс линии Wistar (самцы массой 350-400 г). В течение суток до эксперимента животные лишались пищи без ограничения доступа к воде. После декапитации выделяли сердце, закрепляли аортой на канюлю и перфузировали по Ланген-дорфу при 38°С или 8°С (гипотермия) раствором Тироде. В эксперименте использовали протоколы глобальной ишемии сердца и ишемии в условиях аноксической перфузии без глюкозы. По окончании перфузии вскрывали полость левого желудочка изолированного сердца и выделяли папиллярную мышцу. В работе проводилось исследование перфузии с временными промежутками - 15, 30, 45, 60 мин. Выделенная ткань папиллярной мышцы монтировалась на держатель, замораживалась в жидком пропане (-188°С) и помещалась в камеру криостата (-30°С) с последующим изготовлением криосрезов толщиной 10 мкм. Криосрезы помещали в охлажденный медный контейнер, который переносили в парах жидкого азота на столик вакуумной установки MIKRO BA (BALZERS), где криосрезы лиофилизировались 12 ч в вакууме 5·10^{-5 мм рт.ст. при постепенном повышении температуры столика от -190°С} до комнатной температуры. Высушенные криосрезы монтировались на медную сеточку для электронного микроскопа и в вакуумной камере установки JEE-4B (JEOL) на их поверхность наносили слой углерода путем термического распыления. Измерение внутриклеточной концентрации элементов проводили методом электронно-зондового микроанализа. В основе метода лежит регистрация интенсивности характеристического рентгеновского излучения, ионизируемых в образце ускоренными электронами зонда. Для рентгеновского микроанализа применялся сканирующий электронный микроскоп-микроанализатор JSM-U3 (JEOL). Электронно-зондовый микроанализ проводился при ускоряющем напряжении электронов 25 кВ, токе электронов зонда 5 нА и времени накопления импульсов рентгеновского излучения 40 с. Наиболее интенсивная К_α-линия характеристического спектра анализируемого элемента выделялась на кристалл-анализаторе PET (калий, хлор) и RAP (натрий). Юстировку спектрометров рентгеновского излучения проводили на минералах NaCl и KAlSi₃O₈. Морфологию криосреза наблюдали в режиме вторичных электронов.

В результате анализа результатов было установлено, что глобальная ишемия вызывает в мышечной клетке дефицит калия (94 ± 2 мМ), накопление в цитоплазме натрия (72 ± 4 мМ) и хлора (42 ± 1 мМ) по сравнению с интактной клеткой (122 ± 2 мМ; 36 ± 1 мМ; 24 ± 1 мМ). При ишемии в условиях аноксической перфузии без глюкозы наблюдается плавное уменьшение концентрации калия в клетке до 54 ± 2 мМ при поддержании уровня внутриклеточного натрия (40 ± 1 мМ) и хлора (26 ± 1 мМ). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что на стадии ранней ишемии последовательно активируются мембранные механизмы ионного транспорта, специфичные для гипоксии. Предполагается, что в ишемических условиях активируется и Na/K-АТФаза.

Дата добавления: 2014-11-29