Cхема работы механизма репликации ДНК

В зоне расплетения материнской ДНК на ее цепи, идущей в направлении 5'>3', с помощью фермента праймазы синтезируется короткий (около десятка нуклеотидных остатков) рибонуклеотидный праймер. К 3' концу этого праймера присоединяется ДНКполимераза и синтезирует в качестве его продолжения фрагмент дочерней цепи ДНК, двигаясь при этом по материнской цепи в направлении, обратном направлению движения репликационной вилки. Размер синтезируемого фрагмента дочерней цепи ДНК составляет около 200 нуклеотидных остатков; вполне вероятно, что синтез фрагмента идет в пределах одной полной нуклеосомы. Затем на этой цепи материнской ДНК опять же в районе репликационной вилки с помощью праймазы синтезируется новый праймер, на котором ДНКполимеразой синтезируется очередной фрагмент дочерней цепи ДНК.

Таким образом, дочерняя цепь ДНК, синтезируемая на материнской цепи ДНК, идущей в направлении 3'>5' по ходу движения репликационной вилки, синтезируется несколько раньше и в виде непрерывной цепи. Тогда как синтез дочерней цепи на материнской цепи ДНК, идущей в направлении 5'>3'по ходу движения репликационной вилки, несколько запаздывает во времени и идет в виде фрагментов Оказаки, каждый из которых имеет длину порядка 200 дезоксирибонуклеотидных остатков. Дочерняя цепь ДНК, синтезируемая первой, получила название «ведущей», а цепь, синтезируемая несколько позднее и в виде фрагментов Оказаки носит название «отстающей» цепи.

К настоящему времени установлено, что на «отстающей» цепи в районе репликационной вилки работает надмолекулярный комплекс, состоящий из хеликазы и праймазы так называемая «праймосома», с которым связана и ДНКполимераза, работающая на этой цепи. На ведущей цепи работает еще одна молекула ДНКполимеразы, и,возможно, молекула хеликазы, способная двигаться по этой материнской цепи. Кроме того, в районе репликационной вилки функционируют SSBбелки, стабилизирующие одноцепочечные участки расплетенной молекулы материнской ДНК. Все перечисленные белки входят в надмолекулярную структуру, которую мы и называем репликазным комплексом.

Первоначально синтезированная отстающая цепь ДНК состоит из фрагментов, кроме того в ее состав входят олигорибонуклеотиды праймеры. Уже в ходе репликации праймеры удаляются с помощью специальной РНКазы. Возникающие свободные промежутки на дочерней цепи ДНК застраиваются дезоксирибонуклеотидами с участием фермента bДНКполимеразы, а затем соседние остатки дезоксирибонуклеотидов соединяются с участием фермента ДНКлигазы:

Вновь синтезированные молекулы ДНК подвергаются в клетках ряду преобразований, получивших название «процессинг» ДНК. В ходе процессинга происходит, например, превращение части главных дезоксирибонуклеотидных остатков в минорные, причем эта «миноризация» происходит уже в ходе процесса синтеза ДНК на уже реплицированных ее участках. Кроме того, в ходе процессинга идет формирование третичной структуры новообразованной ДНК, для чего необходимо дополнительное количество ядерных белков.

В Sфазе клеточного цикла происходит интенсивный синтез гистонов, поскольку для структурной организации нового хроматина требуется большое количество этих белков, не уступающее по своей общей массе количеству вновь синтезированной ДНК. В клетках позвоночных содержится около 20 генных блоков, каждый из которых содержит все 5 гистоновых генов. Активация транскрипции этих генных блоков приводит к быстрому увеличению количества гистоновой мРНК в клетке и увеличению скорости синтеза гистонов. В то же время не происходит и гиперпродукции гистонов. Повидимому, это объясняется двумя обстоятельствами: вопервых, гистоновые мРНК нестабильны и быстро разрушаются, причиной чего является своеобразная структура их 3'конца, на котором отсутствует полиаденилатный блок, вовторых, работает механизм обратной связи, контролирующий соответствие количества гистонов в клетке количеству синтезируемой в ней ДНК. Новые гистоны присоединяются к ДНК через несколько минут после ее репликации, но для полного формирования хроматина требуется примерно 1 час, причем в это время происходит химическая модификация гистонов. Вновь сформированные нуклеосомы, как и нуклеосомы материнской ДНК, распределяются случайным образом между двумя дочерними молекулами ДНК.

Точность работы ДНКполимеразы не абсолютна, частота ошибочно включенных во вновь синтезируемую цепь ДНК «неправильных» дезоксирибонуклеотидов составляет 1х104 1х105. В то же время точность репликации ДНК столь велика, что частота ошибок не превышает 1х109. Эта высочайшая точность воспроизведения генетической информации обусловлена наличием в клетках специальных механизмов коррекции ошибок. Вновь синтезированная молекула ДНК сканируется, а ошибки репликации, возникающие изза не 100% надежности работы ДНКполимеразы, устраняются. Однако механизм или механизмы коррекции ошибок в клетках эукариот изучены пока недостаточно.

2.2.Транскрипция или синтез РНК

Синтез РНК или транскрипция представляет собой первый этап реализации генетической информации, в ходе которого эта информация переписывается на молекулы РНК и только в этом виде становится доступной для ее использования в клетке. В результате транскрипции образуются, вопервых, мРНК, несущие информацию о последовательностях аминокислот в полипептидных цепях белков, вовторых, структурные РНК: рРНК, тРНК, мяРНК, непосредственно выполняющие те или иные функции в клетке.

Основная масса РНК синтезируется в клетке в интерфазе, причем скорость синтеза отдельных молекул РНК в клетке примерно в 20 раз превышает скорость синтеза ДНК в Sфазе клеточного цикла. Вместе с тем, синтез РНК носит достаточно избирательный характер.

Так, в большинстве клеток млекопитающих функциональные последовательности различных классов РНК копируются в целом примерно с 1% последовательностей ДНК. Существенно также то, что в клетках разных типов транскрибируется 2 класса генов. Один класс генов, известных под названием «гены домашнего хозяйства», транскрибирует

ся практически во всех клетках, а продукты этих генов отвечают за процессы жизнеобеспечения клеток, например, обеспечивают синтез в клетках ферментов гликолиза или ферментов цикла трикарбоновых кислот. Второй класс генов транскрибируется только в клетках той или иной ткани, а продукты этих тканеспецифичных генов отвечают за синтез белков, обеспечивающих выполнение то или иной тканью своих специализированных функций. Примером могут служить гены, транскрибируемые в гепатоцитах и обеспечивающие синтез белков, участвующих в работе системы свертывания крови.

Синтез функционально активных молекул РНК можно разделить на два этапа. На первом этапе происходит сборка молекулы той или иной РНК на соответствующем структурном гене ДНК; собственно это и есть непосредственно процесс транскрипции. Однако в результате транскрипции получается не готовая молекула той или иной РНК, а ее функционально неактивный предшественник. Такую РНК обычно называют первичным транскриптом соответствующего гена. На втором этапе первичный транскрипт подвергается достаточно сложной структурной перестройке так называемому процессингу, в ходе которого из первичного транскрипта и формируется функционально активная молекула того или иного класса РНК.

2.2.1.Синтез первичного транскрипта

В клетках эукариот синтез молекулы РНК на ДНК происходит в подавляющем большинстве случаев в пределах кодирующей области одного гена, причем транскрипции подвергается только одна из двух цепей ДНК. Эта цепь ДНК получила название кодирующей цепи ДНК данного гена, иногда её называют также значащей цепью. Вторая цепь ДНК этого гена некодирующая цепь. Существенным является то обстоятельство, что у двух соседних генов кодирующей цепью могут служить разные цепи ДНК.

Процесс синтеза РНК носит консервативный характер. Это означает, что после синтеза РНК структура участка ДНК, на котором шел этот синтез, полностью восстанавливается; с другой стороны, ни один из структурных элементов участка ДНК, на котором шла транскрипция, не попадает в состав структуры новообразованной РНК.

Пластическим материалом для синтеза РНК служат только главные рибонуклеозидтрифосфаты. Реакция включения одного рибонуклеотидного остатка в синтезируемую цепь РНК может быть представлена в следующем виде:

Кодирующая цепь ДНК (НуМФ)n + НуТФ Д> (НуМФ)n+1 + ФФ, РНКполимераза где (НуМФ)n синтезируемая цепь РНК.

Ферментом, катализирующим синтез РНК на значащей цепи ДНК является ДНКзависимая РНКполимераза, которую часто сокращенно именуют как РНКполимераза. Этот фермент синтезирует цепь РНК в направлении 5'>3', работая на антипараллельной, т.е. идущей в направлении 3'>5' кодирующей цепи ДНК. Каждый очередной рибо

нуклеотидный остаток присоединяется к строящейся цепи РНК лишь в том случае, если его азотистое основание комплементарно азотистому основанию очередного дезоксирибонуклеотидного остатка матричной цепи ДНК. В результате при участии РНКполимеразы на кодирующей цепи ДНК того или иного гена синтезируется комплементарная ей цепь РНК. Между прочим, последовательность азотистых оснований в синтезированной РНКполимеразой цепи РНК соответствует их последовательности в некодирующей цепи ДНК того же гена с учетом замены урацила на тимин, т.е. «У» в РНК на «Т» в ДНК,

В клетках эукариот в процессах транскрипции участвует 3 РНКполимеразы: РНКполимераза I ответственна за синтез рРНК, РНКполимераза II за синтез мРНК и РНКполимераза III за синтез тРНК и одной из рРНК 5SРНК. Все эти ферменты обладают сложной субъединичной структурой, а их молекулярная масса составляет 500600 тысяч дальтон.

Процесс синтеза первичного транскрипта принято разделять на 3 этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. В ходе инициации запускается синтез РНК на значащей цепи ДНК. Эукариотическая РНКполимераза, в отличие от бактериальных ферментов, не способна сама присоединяться к промотору того или иного гена. Для этого необходимы специальные белки факторы транскрипции, которые присоединяются к определенным блокам нуклеотидов промотора. РНКполимеразы I,II и III требуют присутствия различных факторов транскрипции, обозначаемых TFI, TFII и TFIII соответственно. Для каждой из РНКполимераз известно несколько белков факторов транскрипции, каждый из которых имеет свое обозначение за счет добавления большой буквы к групповому обозначению факторов транскрипции. Так, белок фактор транскрипции РНКполимеразы II, связывающийся с ТАТАбоксом промотора, обозначается как TFIID, а фактор транскрипции TFIIIA участвует в связывании РНКполимеразы III с геном, кодирующим 5SрРНК.

Для инициации синтеза мРНК к промотору соответствующего гена должно быть присоединено как минимум два фактора транскрипции, связывающиеся с его СААТбоксом и ТАТАбоксом. В составе промоторов различных генов имеются и другие блоки нуклеотидов, связывающие другие факторы транскрипции. Белки факторы транскрипции, связавшись с нуклеотидными блоками промотора, обеспечивают связывание РНКполимеразы и ее ориентацию на стартовую точку кодирующей области гена.

Присоединившись к промотору гена РНКполимераза раскручивает двойную спираль ДНК на протяжении 17 пар нуклеотидов, причем по мере синтеза РНК и продвижения РНКполимеразы по кодирующей области гена происходит и перемещение этого участка раскрученной ДНК. Возможно, за раскручивание двойной цепи ДНК отвечает специальный белок, ассоциированный с РНКполимеразой.

Определив кодирующую цепь ДНК и найдя стартовую точку, РНКполимераза отбирает из окружающей среды два рибонуклеозидтрифосфата, азотистые основания которых комплементарны азотистому основанию дезоксирибонуклеотидного остатка стартовой точки и азотистому основанию соседнего дезоксирибонуклеотидного остатка кодирующей цепи ДНК с ее 5' стороны и соединяет эти рибонуклеотидные остатки между собой за счет образования между ними 3,'5'фосфодиэфирной связи, начав таким образом процесс синтеза молекулы РНК. Интересно, что первым нуклеотидным остатком при синтезе мРНК всегда оказывается остаток пуринового нуклеотида.

Далее идет удлинение синтезируемой молекулы РНК или элонгация. Элонгация идет циклически: РНКполимераза отбирает из окружающей среды очередной рибонуклеозидтрифосфат с азотистым основанием, комплементарным азотистому основанию очередного дезоксирибонуклеотидного остатка матричной цепи ДНК, присоединяет очередной рибонуклеотидный остаток к синтезируемой цепи РНК и продвигается по ДНК на одну пару дезоксирибонуклеотидов. Затем цикл повторяется.

Спиральная структура матричной ДНК после прохождения РНКполимеразы сразу же восстанавливается. Синтезируемая цепь РНК растет в направлении 5'>3', причем синтез идет на антипараллельной цепи ДНК, т е на цепи, идущей в направлении 3'>5'. В пределах кодирующей области гена считываются и экзоны и интроны, так что новосинтезированная молекула РНК первичный транскрипт содержит в своем составе рибонуклеотидные последовательности, эквивалентные как экзонам, так и интронам. Средняя длина первичных транскриптов составляет около 8 000 нуклеотидов, однако встречаются первичные транскрипты длиной до 20 000 нуклеотидов.

Окончание процесса синтеза РНК, т.е. терминация, происходит за пределами кодирующей области гена гдето в районе спейсера. Сигналы терминации синтеза РНК на данном гене существуют, однако они до настоящего времени плохо изучены. Обычно РНКполимераза проходит конец последнего экзона, продолжая синтезировать РНК, однако в последствии этот лишний участок РНК, размеры которого могут составлять несколько сотен рибонуклеотидных остатков, удаляется из первичного транскрипта в ходе процессинга.

Дата добавления: 2015-01-03