Процессинг РНК

Процессинг РНК рассмотрим в основном на примере процессинга мРНК, в отношении остальных классов РНК отметим лишь особенности процессинга их первичных транскриптов.

Первичные транскрипты мРНК, составляющие основную массу гяРНК, существенно отличаются от зрелых мРНК уже по своим размерам. Большие размеры гяРНК обусловлены тем, что в составе гяРНК есть последовательности нуклеотидов, эквивалентные интронам; кроме того, на 3'Д конце молекулы имеется излишняя последовательность, образующаяся за счет проскакивания РНКполимеразы на спейсер за конец последнего экзона кодирующей области гена. Следует также отметить, что в первичном транскрипте на его 5' конце отсутствует КЭП, а на 3'Д конце нет полиаденилатного блока. Наконец, первичный транскрипт синтезируется только из главных нуклеотидов, тогда как в молекулах зрелых РНК присутствуют минорные нуклеотиды. Таким образом, процессинг мРНК должен включать в себя вопервых, кэпирование первичного транскрипта, вовторых, удаление последовательностей, эквивалентных интронам с последующим соединением участков РНК, эквивалентным экзонам так называемый сплайсинг, в третьих, формирование 5'конца молекулы, включающее в себя удаление лишней последовательности нуклеотидов и присоединение полиаденилатного блока, в четвертых, превращение части главных нуклеотидов в минорные.

Кэпирование будущей молекулы мРНК происходит уже в ходе синтеза первичного транскрипта, когда длина синтезированной молекулы РНК достигает примерно 30 нуклеотидных остатков. К 5'концевому остатку синтезируемой цепи РНК вначале присоединяется с помощью пирофосфатной связи гуаниловый нуклеотид, а затем гуанин этого нуклеотидного остатка метилируется. Кроме того, метилированию подвергается остаток рибозы соседнего нуклеотидного остатка, так что на 5' конце молекулы формируется структура:

Формирование 3'конца молекулы идет в два этапа: на первом этапе от первичного транскрипта удаляется лишняя 3'концевая последовательность. В конце последнего экзона любого гена имеется последовательность дезоксирибонуклеотидов, при считывании которой на расстоянии от 10 до 30 нуклеотидов до точки разрезания первичного транскрипта в его структуре появляется последовательность ААUААА. Специальный фермент полиАполимераза узнает эту последовательность и отщепляет от первичного транскрипта всю излишнюю последовательность нуклеотидов, а затем присоединяет к 3'концу молекулы от 100 до 200 остатков адениловой кислоты, формируя таким образом полиаденилатный блок на 3'конце молекулы.

Интересно, что и кэпирование, и полиаденилирование возможно только в присутствии РНКполимеразы II. Повидимому, ферменты, ответственные за эти два процесса, тесно связаны с РНКполимеразой II и в ее отсутствии неактивны.

Сплайсинг, т.е. удаление из первичного транскрипта последовательностей, эквивалентных интронам, представляет собой достаточно сложную задачу, в особенности если вспомнить, что число интронов в некоторых генах составляет несколько десятков. По современным представления этот процесс идет на структурно организованных частицах сплайсосомах, основу которых составляют специальные белки. В состав сплайсосом входят также малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы, причем именно последние ответственны за разрезание первичных транскриптов с удалением интронов и последующим соединением концов экзонов. Принято считать, что для удаления каждого интрона необходимо формирование отдельной сплайсосомы.

Схема сплайсинга, включающая промежуточное образование

Превращение главных нуклеотидов РНКтранскрипта в минорные начинается уже по ходу сборки рибонуклеотидной цепи и продолжается в течение всего процессинга. По некоторым данным оно может продолжаться и после поступления мРНК в цитозоль. Эта «миноризация» нуклеотидов включает в себя достаточно большое количество вариантов их химической модификаци, такие как метилирование азотистых оснований и рибозы, гидроксиметилирование и ацетилирование азотистых оснований, восстановление урацила до дигидроурацила или преобразование уридиловой кислоты в псевдоуридиловую кислоту, встречается также и гликозилирование главных мононуклеотидов. Из различных природных объектов выделено около 50 вариантов минорных нуклеотидов.

Синтезированные молекулы мРНК перемещаются из ядра в цитозоль. К настоящему времени мало что известно о механизме этого процесса. Предполагают, что в ядерных порах имеются специальные белкирецепторы, которые «узнают» зрелые мРНК и с помощью механизма активного транспорта переносят их через ядерную мембрану. Молекулы мРНК, не прошедшие полностью процессинг, не могут участвовать в этом переносе. Рибосомальная РНК синтезируется на тандемно расположенныхкопиях идентичных генов. В геноме человека имеется около 200 копий гена в расчете на гаплоидный геном. Тандемы этих генов расположены на 5 различных хромосомах. Гены транскрибируются РНКполимеразой I, причем первичный транскрипт содержит рибонуклеотидные последовательности 3 из 4 рибосомных РНК: 18SРНК, 28SРНК и 5,8S РНК. В ходе процессинга происходит разрезание первичного транс крипта с удалением лишних последовательностей. Четвертая молекула рРНК 5SРНК образуется отдельно. Гены рРНК расположены в петлях ДНК, находящихся в ядрышке. Здесь же происходит и образование готовых молекул рРНК. Непосредственно в ядрышке рРНК взаимодействуют с поступающими сюда белками с образованием рибосом. Далее рибосомы из ядрышка поступают в цитозоль, где происходит их окончательное формирование за счет взаимодействия с цитозольными белками.

Транспортные РНК и 5SрРНК синтезируются с участием РНКполимеразы III. Молекулы тРНК первоначально образуются в виде больших предшественников, которые обычно содержат нуклеотидные последовательности для нескольких молекул тРНК. Эти первичные транскрипты подвергаются нуклеолитическому процессингу под действием специальных нуклеаз, в ходе которого из общего предшественника выделяются отдельные нуклеотидные последовательности, характерные для той или иной тРНК. Кроме того, в составе генов некоторых тРНК имеется интрон, он также удаляется в ходе нуклеолитического процессинга. Дальнейшая модификация молекул тРНК включает в себя превращение части главных нуклеотидов, из которых был синтезирован первичный транскрипт, в минорные за счет разных вариантов их химической модификации, а также присоединение к 3'концу молекулы тринуклеотида ССА, служащего акцепторным концом каждой тРНК.

2.3.Синтез белковых молекул в клетках эукариот

Процесс биосинтеза белка часто отождествляется с понятием «трансляция», хотя два этих термина далеко не равнозначны. В понятие «биосинтез белка» входят следующие процессы:

а).Подготовка пластического материала для сборки полипептидных цепей на рибосомах процесс рекогниции (узнавания).

б).Сборка полипептидных цепей на рибосомах в соответствии с информацией, поставляемой на рибосомы мРНК процесс трансляции.

в).Процессинг полипептидных цепей с образованием функционально полноценных белковых молекул.

В то же время, безусловно, процесс трансляции представляет собой заключительную фазу реализации генетической информации в системе ее переноса в генеральном направлении: ДНК Д> РНК Д> Белок.

Общая схема процессов, обеспечивающих синтез белка в клетках:

2.3.1.Аминокислотный код и процесс рекогниции

Как известно, последовательность аминокислот в полипептидных цепях белков зашифрована в виде последовательности троек дезоксирибонуклеотидов или триплетов дезоксирибонуклеотидов в значащей цепи гена ДНК или в виде последовательности триплетов рибонуклеотидов в зоне трансляции мРНК. Поскольку непосредственно в синте

зе полипептидных цепей белков принимает участие мРНК, аминокислотный код обычно представляют в виде последовательности азотистых оснований триплетов РНК.

Из четырех главных нуклеотидов РНК с учетом последовательности их расположения можно получить 64 триплета или кодона. 3 из них не кодируют ни одной аминокислоты и служат сигналами об окончании сборки полипептидной цепи,это терминирующие кодоны УАА, УАГ и УГА. Таким образом, на 20 аминокислот приходится 61 кодон.

Основные свойства генетического кода:

а). Код триплетный.

б). Код вырожденный большинство аминокислот кодируются

с помощью нескольких кодонов. Например, для Лей 6 кодонов, для Ала 4 кодона; только Мет и Три имеют по одному кодону.

в). Код однозначен каждый триплет кодирует только 1 аминокислоту.

г). Код универсален на всех уровнях живых систем конкретная аминокислота кодируется одними и теми же триплетами. Исключения из этого правила встречаются, но крайне редко к настоящему времени известно лишь четыре таких случая.

д). Код неперекрывающийся соседние кодоны не имеют общих нуклеотидов.

е). Код без запятых между кодонами нет вставочных нуклеотидов.

Один из кодонов АУГ имеет дополнительную нагрузку он выполняет функцию инициирующего кодона, если он расположен в начале зоны трансляции мРНК.

Между кодонами мРНК и соответствующими им аминокислотами нет комплементарности, в связи с чем сама последовательность кодонов мРНК не может непосредственно определять последовательность соединения аминокислот в полипептид, подобно тому, как это происходит репликации или в ходе транскрипции. Необходимы молекулыадапторы, которые, с одной стороны, могли бы связывать определенную аминокислоту, а с другой за счет комплементарного взаимодействия с кодонами мРНК обеспечивать нужную последовательность соединения аминокислот между собой в соответствии с последовательностью кодонов мРНК. Эту функцию выполняют тРНК.

Каждая тРНК в своей структуре имеет антикодон, способный к комплементарному взаимодействию с соответствующим кодоном мРНК, однако тРНК не имеют в своей структуре участков, комплементарных той или иной аминокислоте. Присоединение аминокислоты к «своей» тРНК, например, Ала к тРНКАла, осуществляется с помощью специальных ферментов аминоацилтРНКсинтетаз. Каждая аминоацилтРНКсинтетаза катализирует двухстадийную реакцию, на первом этапе которой в активном центре фермента связывается молекула»своей» аминокислоты и молекула АТФ. Так, в активном центре аланиновой аминоацилтРНКсинтетазы связывается именно Ала и никакая другая аминокислота. Фермент катализирует реакцию образования аминоациладенилата:

АминоацилтРНК

Аминокислота + АТФ > Аминоацил ~ АМФ + ФФ

синтетаза

Остаток аминокислоты связывается макроэргической связью с фосфатной группой АМФ. Образовавшийся аминоациладенилат остается связанным с активным центром фермента.

На втором этапе к активному центру фермента присоединяется тРНК, антикодон которой комплементарен кодону аминокислоты, связанной в активном центре в виде аминоациладенилата. Фермент катализирует реакцию переноса аминокислоты с АМФ на акцепторный тринуклеотид тРНК (3'АССтРНК), причем перенос аминокислотного остатка сопровождается и переносом энергии, т.е. связь между остатком аминокислоты и тРНК также макроэргическая.

Аминоацил

Аминоацил~АМФ + АССтРНК Д> Аминоацил~АССтРНК + АМФ

тРНКсинтетаза

В каждой клетке имеется как минимум 20 различных аминоацилтРНКсинтетаз, по одной на каждую из 20 аминокислот. Точность работы этих ферментов чрезвычайно важна, так как дальнейшая судьба аминокислоты, т.е. место ее включения в полипептидную цепь, зависит только от тРНК. В специально проведенных экспериментах было показано, что если к тРНКАла присоединить другую аминокислоту, например, серин, то в синтезируемой полипептидной цепи вместо аланина будет включаться серин.

АминоацилтРНКсинтетазы в определенной степени способны контролировать точной своей работы: если на первом этапе в активном центре фермента образовался «неправильный» аминоациладенилат, содержащий «чужую» аминокислоту, то на втором этапе в ходе связывания в активном центре своей тРНК происходит опознание возникшей ошибки и «неправильный» аминоациладенилат расщепляется. Наличие такого контролирующего механизма позволяет существенно снизит частоту ошибок при последующей сборке полипептидных цепей белков.

2.3.2.Синтез полипептидных цепей на рибосомах (транскрипция)

Сборка полипептидных цепей белков в соответствии с информацией, поступающей из ядра с матричной РНК, происходит на рибосомах. Рибосомы эукариот представляют собой клеточную органеллу, состоящую из двух частей субъединиц: малой или 40S субъединицы, в состав которой входит 18S рРНК и 33 молекулы белков, и большой или 60S субъединицы, имеющей в своем составе три молекулы рРНК (28S, 5,8S и 5S) и 45 белковых молекул. В составе рибосомы имеется 4 функциональных центра: центр связывания мРНК; центр связывания тРНК, несущей синтезируемую полипептидную цепь или Пцентр: центр связывания тРНК, несущей очередную аминокислоту, которая будет присоединяться к синтезируемой полипептидной цепи Ацентр;

Тцентр или пептидилтрансферазный центр, обеспечивающий образование пептидных связей в синтезируемом полипептиде:

Процесс транскрипции принято делить на три этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Для инициации синтеза полипептида необходимы рибосома, диссоциированная на субъединицы; инициирующая мРНК, в качестве которой в клетках эукариот используется тРНКМет, нагруженная метионином; мРНК; ГТФ; кроме того, необходимо нес

колько белков, так называемых факторов инициации: эФИ1, эФИ2, эФИ3, эФИ4(А,В,С), причем фактор инициации эФИ3 необходим для диссоциации рибосомы на субъединицы.

Затем мРНК вместе с КЭПсвязывающим белком взаимодействует с малой субъединицей рибосомы, нагруженной МеттРНК. Для этого взаимодействия необходимы факторы инициации эФИ1, эФИ4А, эФИ4Б, кроме того, в ходе взаимодействия расщепляется молекула АТФ. Для эффективного связывания мРНК с малой субъединицей рибосомы абсолютно необходим КЭП, в отсутствии КЭПа связывания мРНК с 40Sсубъединицей практически не происходит.

Мет ИФ3

Далее малая субъединица продвигается по мРНК в направлении от ее КЭПа к 3'концу, пока не достигнет инициирующего кодона АУГ. В составе мРНК всегда имеется несколько кодонов АУГ, которые в пределах ее транслируемой зоны кодируют метионин, присутствующий в полипептидных цепях белков. Для опознания кодона АУГ в качестве именно инициирующего кодона важно его окружение. Оптимальной последовательностью нуклеотидов для опознания инициирующего кодона является последовательность АЦЦАУГГ.

Сформировавшийся комплекс, состоящий из малой субъединицы рибосомы, связанной с мРНК и инициаторной МеттРНК подучил название инициирующего комплекса. Этот инициирующий комплекс взаимодействует с большой (60S) субъединицей рибосомы, причем МеттРНК оказывается в Пцентре рибосомы. В ходе этого взаимодействия происходит расщепление ГТФ до ГДФ и Ф, высвобождается КЭПсвязывающий белок и ряд факторов инициации (эИФ2, эИФ3 и др.)

После присоединения большой субъединицы рибосомы МеттРНК оказывается в Пцентре рибосомы, а Ацентр свободен и может связывать следующую аминоацилтРНК, антикодон которой комплементарен кодону мРНК, находящемуся в Ацентре рибосомы. На этом заканчивается этап инициации.

На следующем этапе этапе элонгации происходит последовательное присоединение аминокислотных остатков к синтезируемой полипептидной цепи в направлении от её Nконца к Сконцу. Процесс элонгации идет циклически, причем в ходе цикла полипептидная цепь увеличивается на один аминокислотный остаток.

Цикл элонгации начинается с взаимодействия аминоацилтРНК (АатРНК), антикодон которой комплементарен кодону мРНК, находящемуся в Ацентре рибосомы, с ГТФ и белковым фактором элонгации I (ФЭ1):

Образовавшийся комплекс взаимодействует с рибосомой. В ходе взаимодействия АатРНК связывается в Ацентре рибосомы так, что ее антикодон взаимодействует с кодоном мРНК. ГТФ в ходе взаимодействия расщепляется до ГДФ и Ф, обеспечивая процесс энергией. После расщепления ГТФ фактор элонгации ФЭ1 высвобождается и покидает

рибосому. В результате в Ацентре рибосомы оказывается АатРНК, а в Пцентре оказывается тРНК, несущая синтезируемую полипептидную цепь (или МеттРНК, если речь идет о первом цикле элонгации):

Под действием пептидилтрансферазы Тцентра рибосомы синтезируемая полипептидная цепь с тРНК, находящейся в Пцентре рибосомы (или остаток метионина с МеттРНК) переносится на NH2группу аминокислоты, связанной с тРНК в Ацентре рибосомы с образованием пептидной связи. Необходимая для образования пептидной связи энергия, высвобождается за счет разрыва макроэргической связи между аминокислотным остатком и тРНК.

После переноса пептидильного остатка свободная тРНК покидает Пцентр рибосомы, а рибосома при участии фактора элонгации ФЭ2 передвигается по мРНК в направлении её 3'конца на расстояние, равное одному кодону. Энергетика этого перемещения рибосомы по мРНК обеспечивается гидролизом молекулы ГТФ до ГДФ и Ф. В результате перемещения рибосомы в её Пцентре оказывается тРНК, несущая синтезируемый полипептид (или дипептид на нашей схеме), а в её Ацентре следующий кодон матричной РНК:

Рибосома готова к новому циклу элонгации. Количество циклов элонгации определяется количеством кодонов в зоне трансляции мРНК. На образование каждой пептидной связи клетка затрачивает 4 макроэргических эквивалента: 2 из них затрачиваются на образование аминоацилтРНК, поскольку в ходе реакции, катализируемой аминоацилтРНКсинтетазой, АТФ расщепляется до АМФ и 2Ф; еще 2 затрачиваются в цикле элонгации, так как в ходе каждого цикла 2 ГТФ расщепляются до 2ГДФ и 2Ф.

После многих циклов элонгации, в результате которых синтезируется полипептидная цепь того или иного белка, в Ацентре рибосомы оказывается один из терминирующих кодонов: УАА, УГА, УАГ. Начинается следующий этап этап терминации транскрипции. Появление в Ацентре терминирующего кодона узнается с помощью белковых высвобождающих факторов или Rфакторов. Rфакторы при участии ГТФ и пептидилтрансферазы Тцентра рибосомы гидролизуют связь между синтезированным полипептидом и тРНК, находящейся в П центре рибосомы. Синтезированный полипептид уходит с рибосомы. Далее из Пцентра рибосомы уходит освобожденная от синтезированного полипептида тРНК, а затем рибосома покидает мРНК. Свободная рибосома диссоциирует на субъединицы и может начинать синтез новой полипептидной цепи.

На одной и той же мРНК может работать одновременно несколько рибосом. Изза довольно большого собственного размера рибосом они располагаются на мРНК на расстоянии не менее 80 нуклеотидных остатков друг от друга, тем не менее на одной молекуле мРНК могут одновременно работать несколько десятков рибосом. Рибосомы, работающие на одной молекуле мРНК, образуют полирибосому или полисому.

В оценке скорости синтеза полипептидной цепи в клетках эукариот в литературе существуют большие разногласия: от 100 аминокислотных остатков в минуту до 2000 в мин. Частота ошибок сборки полипептидных цепей составляет 1х104. При средней длине полипептидных цепей белков в 400 аминокислотных остатков 1 дефектная молекула приходится на 25 синтезированных молекул белков.

Точность сборки полипептидных цепей контролируется на двух этапах: вопервых, на стадии образования аминоацилтРНК, вовторых. на стадии связывания аминоацилтРНК с Ацентром рибосомы на этапе элонгации. Если к Ацентру рибосомы присоединяется АатРНК, антикодон которой не комплементарен кодону мРНК, также находящемуся в Ацентре рибосомы, связь этой ошибочной АатРНК с Ацентром непрочная и эта АатРНК покидает Ацентр раньше, чем сработает механизм образования пептидной связи.

Дата добавления: 2015-01-03