Введение. Учебно-методическое пособие

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению подготовки 011800 «Радиофизика» и 020400 «Биология». Профиль "Биофизика".

Нижний Новгород

УДК 591.181 (077)

ББК Е 91/99 р

П32

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ В КУЛЬТУРАХ ГИППОКАМПА: СТИМУЛЯЦИЯ, РЕГИСТРАЦИЯ И АНАЛИЗ. Авторы: Пимашкин А.С., Гладков А.А., Симонов А.Ю., Мухина И.В., Казанцев В.Б. Учебно-методическое пособие. Нижний Новгород: Издательство Нижегородского госуниверситета, 2013. – 25 с.:

Рецензент: д.б.н. Воденеев В.А.

Методическое руководство содержит теоретические и практические основы экспериментальных исследований по регистрации, стимуляции и статистическому анализу биоэлектрических сигналов нейронных сетей первичных культур гиппокампа. Описаны методы регистрации и стимуляции с обратной связью, анализа спонтанной активности культур гиппокампа, а также программные средства, используемые в экспериментах по изучению адаптации нейронных сетей к стимуляции.

Пособие предназначено для магистрантов и аспирантов биологического и радиофизического факультетов для проведения практических занятий и лабораторных работ по мультиэлектродной регистрации активности нейрональных культур.

Подготовлено при поддержке гранта РФФИ офи-м 11-04-12144, ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», контракт № 16.512.11.2136, аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 гг.)» №2.1.1/13659.

Ответственный за выпуск: председатель методической комиссии биологического факультета ННГУ, д.п.н., профессор И.М. Швец

УДК 591.181

ББК Е 91/99 р

©Нижегородский государственный

университет им. Н.И. Лобачевского, 2013

Исследование закономерностей формирования нейрональных сетей является одним из актуальных направлений современной нейронауки. Диссоциированные нейрональные культуры, выращенные на мультиэлектродных матрицах используются как инструмент для исследования фундаментальных принципов функционирования нейронов как элементов в составе нейронной сети. Мультиэлектродные матрицы (MEA – multielectrode array), способны одновременно регистрировать биоэлектрические потенциалы нескольких групп нейронов (Thomas, et al. 1974). Этот метод позволяет не только исследовать активность одной или нескольких отдельно взятых клеток, но и регистрировать последовательность их активации в составе сети (паттерны активности сети), что открывает возможность экспериментально проверять гипотезы о функционировании исследуемых нейросетей. В настоящее время параллельная регистрация сигналов с разных участков нейрональной культуры используется для исследования фундаментальных принципов нейрофизиологии, а также развития информационных приложений, в частности изучение таких феноменов как обучение (Li Y. et al. 2007), память, управление движением и кодирование сенсорной информации (De Marse, 2001).

В используемой мультиэлектродной системе MED64 (Panasonic) каждый электрод имеет форму квадрата со стороной 50 мкм и расстояние между центрами электродов равно 150 мкм. В окрестности одного электрода может располагаться до нескольких десятков клеток (в зависимости от их плотности). Регистрация сигналов производится путём измерения потенциала внеклеточной среды в окрестности электродов.

В работе используется культура нейрональных клеток гиппокампа эмбрионов мышей, выращиваемая на мультиэлектродной матрице. Подобная нейронная сеть способна генерировать спонтанные электрические возбуждения (импульсы), регистрируемые на электродах в форме импульсов с амплитудой 15-80 мкВ.

Одной из основных проблем при анализе сигналов сети нейронов, является достоверное выделение событий (импульсов) на фоне шума. Экспериментально показано, что форма регистрируемого импульса варьируется в различных нейронах, и зависит от типа клетки, концентрации ионных каналов на мембране и расстоянием от клетки до электрода. Для сортировки импульсов по форме широко применяется вэйвлет анализ. Данный анализ позволяет в записи последовательности импульсов выявить типы или основные формы импульсов, наиболее часто генерирующихся нейронами [Quiroga Q., 2004].

Начиная с 10-14 дня развития in vitro, нейроны в культуре формируют спонтанные популяционные разряды (сетевая пачечная активность) - структура которых определяется как динамикой составляющих сеть нейронов, так и архитектурой сети и типом межэлементных связей (Рисунок 1).

Рисунок 1. Популяционный разряд (сетевая пачка) электрической активности нейронной сети. Электрод регистрирует активность нескольких клеток. Штрихом отмечено время генерации импульса на электроде.

Важным вопросом при исследовании сигналов в нейронных сетях является выделение пачек активности для анализа механизмов распространения сигнала в сети клеток. Решение данной проблемы осложняется тем, что пачки формируются на фоне базовой спонтанной активности в сети, и однозначного критерия выделения пачек не существует. Данная проблема имеет различные решения, и рассматривалась в работах (Potter S., 2004; Ben-Jacob E., 2007).

Трактовка спонтанных пачек активности с точки зрения сетевой динамики, а также условия устойчивости и повторяемости во времени их пространственно-временной структуры, на данный момент являются предметом интенсивных исследований. С функциональной точки зрения, наличие воспроизводимости в структуре пачки может служить индикатором передачи сигналов между нейронами посредствам стабильной синаптической архитектуры сети. Популяционные разряды, в частности, могут быть связаны с увеличением концентрации нейромедиатора в синапсе, которое повышает вероятность повторной генерации потенциала действия.

В разных областях электрофизиологии под пачечной активностью нейронной сети подразумевают различные явления. В области исследования нейронных сетей с помощью MEA, под ней подразумеваются короткие периоды, в течение которых частота импульсной активности многих клеток (нескольких электродов) превышает базовый уровень.

Различают следующие типы пачечной активности (Рис. 2).

Рисунок 2. Классификация пачечной активности в культуре нейронов. B1 - нет пачек; B2 - крошечные пачки B3 - пачки фиксированного размера B4 - пачки вариабельного размера B5 - продолжительные пачки B6 - нормальные суперпачки B7 - инвертированные суперпачки. B8 - аномальная пачечная активность. ASDR – профиль пачечной активности при суммировании потенциалов действия по всем электродам за 1 с (по Wagenaar DA et.al., 2006)

Популяционные разряды нейронных сетей представляют собой повторяющиеся паттерны на фоне базовой активности. Установлено также, что при химическом воздействии в культуре могут возникать новые паттерны (Baruchi and Ben-Jacob, 2007). Число паттернов и наличие взаимных корреляций между ними связано с морфологией и архитектурой культуры; что подтверждается при исследовании взаимодействий между возбуждающими и тормозными нейронами и геометрии сети.

Следовательно, идентификация паттернов служит важным инструментом исследования клеточных взаимодействий в нейронной сети. В данной работе описывается принцип детектирования одиночных импульсных событий и выделения сетевых пачек, регистрируемых внеклеточными электродами МЭА.

Глава 1 Проведение экспериментов по обучению клеток культуры гиппокампа

Дата добавления: 2014-12-25