Определение каталазной активности в интактных эритроцитах по методу Крайнева

Лабораторно-практические работы.

Обезвреживание перекиси водорода ферментом каталазой.

В организме существуют защитные механизмы:

- гемсодержащие ферменты: каталаза, которая расщепляет Н₂О₂:

каталаза

2Н₂О₂ 2Н₂О + 2О₂

- супероксиддисмутаза (СД), глутатионпероксидаза, обезвреживающие О₂ˉ:

СД

2О₂^- + 2Н⁺ 2Н₂О₂ + О₂

каталаза

2Н₂О₂ 2Н₂О + 2О₂

- антиоксиданты, обезвреживающие свободные радикалы – витамины Е, А, С; глутатион, цистеин, биофлавоноиды, Q₁₀, мочевая кислота, янтарная кислота, селенит натрия и др.

Об активности каталазы можно судить либо по количеству перекиси водорода, разложившейся под влиянием этого фермента, либо по количеству выделившегося при этом кислорода. По методу Крайнева активность каталазы выражают в микромолях перекиси водорода, разложенной 1 мл крови в течение минуты. Каталаза крови содержится почти исключительно в эритроцитах. Активность этого фермента снижается при некоторых заболеваниях, например анемии, туберкулезе, раке и др.

Ход работы:

1. Приготовить суспензию эритроцитов: отмерить в пробирку 5 мл 0,85% раствора хлористого натрия и добавляют туда 0,1 мл крови, тщательно перемешивая.

2. Отмерить в две пробирки по 5 мл 10% раствора серной кислоты.

3. Отмерить в два тигля по 2 мл 0,5 М раствора перекиси водорода.

4. Отмерить в два стакана по 6 мл 0,85% раствора хлористого натрия и по 2 мл суспензии эритроцитов.

5. С помощью пинцета поместить на дно каждого стакана тигель с перекисью водорода.

6. В первый стакан (контроль) влить из пробирки 5 мл 10% раствора серной кислоты и перемешать содержимое (инактивация каталазы).

7. Второй стакан с тиглем (опыт) вращают до перемешивания содержимого, каталаза эритроцитов начинает разлагать перекись водорода. Перемешивание продолжают в течение 30 секунд, после чего вливают в него 5 мл 10% раствора серной кислоты из пробирки. Реакция приостанавливается. Избыток перекиси водорода в обоих стаканах (опыт и контроль) титруют 0,1N раствором перманганата калия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.

Вычисление производят по формуле:

(А - В) ´ 1,7 ´ 2

0,04 ´ 34

1 мл 0,1N раствора KMnO4 эквивалентен 1,7 мг перекиси водорода

0,04 – количество крови в стакане

А – количество миллилитров 0,1N раствора KMnO4, пошедшего на титрование контрольного стакана,

В – количество миллилитров 0,1N раствора KMnO4, пошедшего на титрование опытного стакана,

В норме активность каталазы равна 12-20 ммоль/мл/мин.

Дата добавления: 2015-04-24