Полімеразна ланцюгова реакція та секвенування

Величезний обсяг інформації, що міститься в геномі не матиме будь-якої користі для філогенетики, якщо до неї не буде доступу і вона не буде належним чином проаналізована. Після 1985 р. це стало можливим завдяки Кері Муллісу, який винайшов метод, відомий як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (Moolis, Faloona, 1987). Це було важливим досягненням, що дозволило виділяти і збільшувати кількість копій певних регіонів ДНК. Спочатку із зразка виділяється геномна ДНК, тобто вся ДНК, що міститься в досліджуваних клітинах, а потім використовуються два олігонуклеотидні праймери, щоб збільшити кількість копій обраної ділянки ДНК для подальшого аналізу. Праймери, що мають, як правило, довжину 15-35 пар основ, виконують роль стартових точок для синтезу ДНК, вони мусять бути комплементарними фрагментам ДНК, що межують з обраною послідовністю.

Кожний цикл ПЛР має три кроки: денатурація ДНК, приєднання праймерів, подовження нової послідовності, що синтезується (рис. 1.4). Перший крок, денатурація, робиться шляхом підвищення температури приблизно до 94ºС, що викликає розриви водневих зв’язків і подвійний ланцюг ДНК стає одинарним ланцюгом-матрицею. Потім температура знижується до 40 – 65ºС, що дозволяє праймерам приєднатися до комплементарних ділянок, що межують з обраною послідовністю. На останній стадії за температури 72ºС використовуються фермент ДНК-полімераза і вільні нуклеотиди, які додаються до реакційної суміші, щоб подовжити послідовності. Оскільки під час кожного циклу утворюється два дочірні ланцюги на кожний батьківський ланцюг, кількість послідовностей зростає експоненціально протягом ПРЛ. За звичай ПЛР включає 35 циклів, що достатньо для того, щоб отримати з однієї послідовності-матриці 68 мільярдів копій. Широке застосування ПЛР стимулювалося використанням стійкого до високих температур ферменту – Taq-полімерази, названого так через те, що він був виділений з бактерії Thermus aquaticus, яка живе в гарячих джерелах. Оскільки Taq-полімераза не втрачає своєї активності за високих температур, її достатньо додати лише один раз на початку реакції, яка відбувається у програмованому термостаті (ПЛР-ампліфікаторі), що утворює температурні цикли. Як правило, все ж таки необхідна деяка оптимізація, коли використовуються нові праймери або різні види: змінюють температуру приєднання праймерів до ланцюгів ДНК.

Після того, як певна ділянка гену була ампліфікована, виникає необхідність перевірити результати ПЛР для кожного індивідуума. Найпростіший спосіб зробити це – перевірити розміри отриманих продуктів ПЛР, які можуть бути обчислені за допомогою електрофорезу продуктів ПЛР у агарозному або поліакриламідному гелі. У рідкому розчині гелю залишають гребінки, а після того, як гель твердіє, гребінки виймають і в твердому гелі залишаються лунки. Зразки ДНК поміщають у ці лунки, а потім подається електричний струм. Молекули ДНК заряджені негативно і тому рухаються у напрямку до позитивного електрода.

Швидкість, з якою фрагменти ДНК рухаються в гелі під час електрофорезу залежить переважно від їхніх розмірів: великі фрагменти рухаються найповільніше. Фрагменти, що розділилися в гелі залежно від своїх розмірів, можна побачити, якщо використати барвник бромід етидія, який зв’язується з молекулами ДНК і може бути побачений людським оком, коли він ілюмінує у короткохвильовому ультрафіолетовому світлі. Розміри фрагментів ДНК можуть бути екстрапольовані з положення смужок, що ілюмінують, відносно шкали (ladder), яка складається з фрагментів ДНК відомих розмірів (рис. 1.5.).

Найвідоміший метод визначення нуклеотидних послідовностей - секвенування за Сенгером – був винайдений Фредеріком Сенгером (Sanger) у середині 1970-х років. Його протокол був розроблений для синтезу ниті ДНК використовуючи ДНК-полімеразу й окремі нуклеотиди подібно до ПЛР, але з двома важливими відмінностями. По-перше, використовується лише один праймер у ролі стартової точки для синтезу і послідовності будуються на матриці лише в одному напрямку. По-друге, деякі нуклеотиди містять цукор дидезоксирибозу замість дезоксирибози, цукру, який зазвичай міститься в ДНК. Дидезоксирибоза не має 3ʹ-гідроксильної групи, яка є в дезоксирибози, а без неї до ростучої ниті ДНК не може бути доданий наступний нуклеотид. Тому коли нуклеотид з дидезоксирибозою вступає в реакцію, синтез припиняється.

Секвенування за Сенгером відбувається в чотирьох окремих реакціях, кожна з яких включає чотири нуклеотиди в дезоксирибозній формі (dNTPs) і невелику кількість одного з нуклеотидів (А, Т, Г або Ц) у дидезоксирибозній формі (ddNTP). Включення ddNTP в кінці кінців відбуватиметься у кожному сайті послідовності ДНК, що приводить до синтезу фрагментів послідовності довжиною від однієї пари основ до її максимальної довжини. Фрагменти різної довжини генеруватимуться в кожній з чотирьох реакцій і у випадку ручного секвенування рухатимуться різними «доріжками» в гелі. Фрагменти можна візуалізувати в різні способи, включаючи фарбування сріблом або використання радіоактивних міток. Усі фрагменти різних розмірів даної доріжки відповідають позиціям, куди приєдналися дидезоксирибозні нуклеотиди цієї реакції. Наприклад, якщо у реакції, що містить дидезокси форму аденозину, утворюються фрагменти довжиною 1, 5 і 10 пар основ, тоді перша, п’ята і десята основи в послідовності мають бути аденіном (А). Фрагменти з кожної з чотирьох реакцій мають бути зіставлені, щоб отримати всю послідовність (рис. 1.6.).

Хоча ручне секвенування було звичайною справою протягом кількох років, воно замінено тепер на автоматичне секвенування. Так само генеруються фрагменти різної довжини, але нуклеотиди, що містять дидезоксирибозу мітяться флуоресцентними барвниками різного кольору. В цьому випадку немає необхідності проводити реакції окремо, як це було у випадку ручного секвенування, оскільки різні кольори вказують на фрагменти, синтез яких зупиняється кожним типом дидезоксинуклеотидів. Лазер активує флуоресцентні мітки кожної смужки (зазвичай чорний для Г, зелений для А, червоний для Т і синій для Ц). Кожний колір зчитується фотодатчиком і зберігається в комп’ютерному файлі, де послідовність представлена у вигляді різнокольорових піків (рис. 1.7). Якщо підставити відповідну основу під кожний кольоровий пік, можна отримати повну послідовність обраного регіону ДНК.

Для кожного з чотирьох філогенетичних аналізів використовувалися дещо різні методи виділення, ампліфікація і секвенування ДНК. Нижче приводиться опис цих методів для кожного з проведених аналізів.

Для виявлення філогенетичних зв’язків між риб’ячими п’явками та таксонами зовнішньої групи (Utevsky & Trontelj, 2004) використовувалися наступні методи виділення ДНК, полімеразної ланцюгової реакції та секвенування. Маленькі шматочки (приблизно 5Х2Х2 мм) покривів і м'язових тканин були відділені від бічної частини тіла. Приймалися запобіжні заходи, щоб не торкнутися травної системи, яка часто містила кров хазяїна невідомого виду. Геномна ДНК виділялася за допомогою набору GeneElute Mammalian Genomic DNA minprep від Sigma-Aldrich (Стайнгайм, Німеччина). Ампліфікація послідовності 12S рРНК проводилася за Trontelj et al. (1999) з використанням праймерів 12Sa і 12Sb впродовж 30 циклів, кожен з яких складався з 45 с при 94ºС, 45 с при 50ºС і 1 хв. при 72ºС після 3 хв денатурації при 94ºС. Фрагменти гену COI апліфікували, використовуючи праймери LCO 1490 і HCO 2198 за Folmer et al.. (1994) впродовж 34 циклів, кожен з яких складався з 45 с при 94°C, 45 с при 48°C 1 хв при 72°C після 3 хв денатурації при 94°C.

Продукти ПЛР очищали шляхом вимивання (елюції) з 1,5% агарозного гелю, осаджали 2,5 об’ємними частинами 100% етанолу та відмивали 70% етанолом. Секвенування проводилося з використанням праймерів, помічених флуоресцентними мітками (Cy5) і набору реактивів Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit на автоматичному секвенаторі ALF ExpressII (від Amersham Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеція). Загальна довжина фрагменту COI була 653 пар основ, а довжина послідовностей 12S рДНК варіювала від 346 до 350 пар основ.

Для проведення наступного аналізу (Utevsky et al., 2007) застосовувалися дещо інші методи. Фрагмент ядерного гена 28S рРНК був апліфікований, як описано в Zakšek et al. (2006). Ампліфікація мітохондріального гена Лей-тРНК і послідовності субодиниці 1 нікотінамідаденіндинуклеотиддегідрогенази (ND1) проводилася по Light, Siddall (1999). Мітохондріальні послідовності 12S рРНК і субодиниці 1 цитохромоксидази (COI) були ампліфіковані, як описано в Trontelj, Utevsky (2005). Продукти ПЛР були очищені з використанням системи очищення Millipore Montage (Bedford, MA, США). Очищені продукти були секвеновані в обох напрямках з використанням ампліфікаційних праймерів при умовах термінування BigDye, очищені за допомогою етанолу осадженням і запущені в секвенатор Applied Biosystems 3730xl Macrogen (Сеул, Корея). Хроматограми послідовностей були відредаговані й сполучені за допомогою програми ChromasPro 1.32 (Technelysium Pty., Queensland, Австралія).

Для виявлення систематичного статусу та філогенетичних відносин між медичними й іншими щелепними п’явками (Trintelj & Utevsky, 2005) використовувалися наступні методи. Рибосомальний внутрішній проміжок, що транскрибується (ITS2), включно зі значною частиною 5.8S рРНК, ампліфікувався з використанням праймерів ‘ITS3’ та ‘ITS4’ (White et al., 1990). ПЛР здійснювалася з використанням 30 циклів: 45 с за 94ºС, 45 с за 48ºС і 60 с за 72ºС після 3-хвилинної денатурація за 94°C. Для ампліфікації мітохондріальної послідовності 12S рРНК використовувалися праймери: 5ʹ-GCCAGCAGCCGCGGTTA-3ʹ і 5ʹ-CCTACTTTGTTACGACTTAT-3ʹ. Умови проведення циклів ПЛР були ті ж самі, що й для ІТS2 за виключенням температури відпалу - 46 °C. Ген COI ампліфікували, використовуючи праймери LCO 1490 і HCO 2198 (Folmer et al.,1994), та 34 цикли: 45 с за 94°C, 45 с за 48 °C та 1мін за 72 °C після 3-хвилинної денатурації за 94 °C. Усі продукти ПЛР очищували вимиванням з 1,5% агарозного гелю, осаджені 2,5 об’ємними долями 100º етанолу і видмиті 70º етанолом. Секвенування відбувалося за допомогою праймерів, мічених ціаніном Cy5 (послідовності праймерів були ті ж самі, що й для ПЛР), а також набору реактивів Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit і автоматичного секвенатора ALF Express II (Amersham–Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеція).

Для дослідження філогеографії медичних п’явок було застосовано наступні методи. Мітохондріальна 12S рДНК та субодиниця 1 цитохромоксидази (СО1) були ампліфіковані, як це описано в Trontelj & Utevsky (2005). Продукти ПЛР очищали з використанням системи Millipore Montage (Бедфорд, штат Массачусетс, США). Рибосомні внутрішні прогалини, що транскрибуються (ITS1 і ITS2), включаючи ген 5.8S рРНК, також ампліфікувалися (Hillis & Dixon 1991). ПЛР проводили із застосуванням 30 циклів: 45 с при 94° С, 45 с при 48° C і 60 с при 72 ° С, з подальшим 3-хвилинним кроком денатурації при 94° C. Очищені продукти були секвеновані в обох напрямках з використанням ампліфікаційних праймерів і за методикою «BIG DYE Terminator cycling», осаджені етанолом і проаналізовані секвенатором Applied Biosystems 3730xl фірмою Macrogen (Сеул, Корея). Отримані послідовності у вигляді хроматограм були відредаговані за допомогою програми ChromasPro 1.32 (Technelysium Pty., Квінсленд, Австралія). Правильність послідовності СО1 була перевірена на рівні амінокислот.

Дата добавления: 2015-05-23