Вирівнювання нуклеотидних послідовностей

В еволюції нуклеотидних послідовностей відбуваються як заміни, так і вставки та делеції. Першим етапом філогенетичного аналізу є ідентифікація вставок і делецій, які мали місце в еволюційній історії групи послідовностей, що аналізуються. Ця процедура називається вирівнюванням (alignment) послідовностей. Іншими словами, вирівнювання послідовностей спрямоване на виявлення гомологічних (тобто таких, що мають спільне еволюційне походження) позицій у послідовностях, що аналізуються. Для філогенетичного аналізу необхідно порівняти гомологічні структури або ознаки організмів. У випадку нуклеотидних або білкових послідовностей може бути неясним і неочевидним, які саме ознаки слід порівнювати. Ця складність пояснюється тим, що послідовності є наборами лише кількох символів (чотирьох нуклеотидів), порядок яких варіює вздовж послідовності. Слід з’ясувати, які регіони порівнюваних послідовностей є гомологічними, тобто відповідають тому ж самому регіону іншого гена і можуть бути порівняні між собою.

Пара послідовностей може бути вирівняна, коли одна з них написана над іншою таким чином, щоб максимізувати число нуклеотидів, які відповідають один одному, за допомогою додавання проміжків в ту чи іншу послідовність. Біологічний смисл цих проміжків може трактуватися, як вставки (інсерції) або делеції, що відбулися, поки послідовності дивергували від спільного предка.

Якщо вставляти стільки проміжків, скільки це видається можливим, то можна вирівняти будь-які дві випадкові неспоріднені послідовності так, що нуклеотиди або відповідають один одному, або нуклеотиду однієї послідовності відповідає проміжок у іншій послідовності. Однак таке вирівнювання не буде мати сенсу. Необхідно якимось чином обмежити число проміжків, аби вирівнювання мало біологічний смисл. Щоб досягти цього, застосовується система позитивних і негативних оцінок (штрафів): якщо нуклеотиди відповідають один одному, то присуджується позитивна оцінка, проміжки отримують штраф. Комп’ютерна програма шукає такий елайнмент, який отримує максимальну сумарну оцінку.

При вирівнюванні нуклеотидних послідовностей відповідність між нуклеотидами зазвичай оцінюється як 1, а невідповідність як 0. Штрафні очки за проміжки встановлюються, як правило, користувачем; існують штрафи за створення проміжку і додаткові штрафи за збільшення довжини проміжку.

Вирівнювання двох послідовностей не є складним процесом з точки зору обчислення. Однак вирівнювання багатьох послідовностей набагато складніше і для цього застосовується кілька комп’ютерних програм.

Для вирівнювання отриманих послідовностей використовувалися наступні методи. У дослідженні (Utevsky & Trontelj, 2004) фрагменти 12S рДНК та COI вирівнювали за допомогою програми ClustalX, ver.1.8 (Thompson et al., 1997) з параметрами за замовчуванням. Вирівнювання жодним чином не корегувалося, оскільки були лише кілька невеликих проміжків у 12S і проміжки були відсутні у вирівнювання COI.

Подальший аналіз філогенетичних відносин понтобделін (Utevsky et al., 2007) відбувався наступним чином. Ділянки, що кодують гени COI й ND1, мали рівну довжину й були тому однозначно вирівняні вручну. Правильність вирівнювання була перевірена на амінокислотному рівні. Ядерні й мітохондріальні послідовності рибосомальної ДНК мали різну довжину й вирівнювалися з використанням Muscle 3.6 (http://www.drive5.com/muscle/) (Edgar, 2004). Послідовності кожного з п'яти фрагментів ДНК були вирівняні окремо. Об'єднане вирівнювання доступне в TreeBASE (http: // www.treebase.org/treebase /).

Вирівнювання послідовностей ДНК щелепних п’явок (Trontelj & Utevsky, 2005) здійснювалося наступними методами. Довжина отриманих фрагментів послідовностей СОI була близько 630 пар основ. Вони були однозначно вирівняні вручну без використання комп’ютерних програм. Правильність вирівнювання була перевірена на рівні амінокислот. ITS2 та 12S рДНК послідовності суттєво відрізнялися за своєю довжиною, особливо коли додали види зовнішньої групи (502–564 і 482–505 пар основ відповідно). Попереднє вирівнювання за допомогою програми CustalX (Thompson et al., 1997) з параметрами за умовчанням виявило потенційно непевні позиції в обох генах. Застосовувався так званий підхід чутливості, запропонований Gatesy et al. (1993) і використаний у програмі SOAP (Löytynoja & Milinkovitch, 2001), щоби визначити позиції, які чутливі до змін значень штрафних очок при відкритті та подовженні проміжків (інделів). Штрафні очки за відкриття проміжків варіювали від 7 дo 19, а за подовження проміжків – від 3 до 9. Виявилося, що блоки з непевним вирівнюванням містили важливу частину філогенетично інформативних позицій. Вилучення цих позицій призводить до дерев з багатьма невизначеностями. Тому порівнювали попередні дерева, отримані з різних вирівнювань без виключення сайтів, для виявлення можливого конфлікту між топологіями. Усі 28 дерев, що порівнювались, мали однакові топології, але вони відрізнялися за ступенем підтримки внутрішніх вузлів. Оскільки не було конфлікту у філогенетичному сигналі між різними вирівнюваннями, жодні

Таблиця 1.6. Основні властивості вирівняних послідовностей медичних п’явок
Послідовність	Довжина	OP/EP	#var	#inf	%А	%Ц	%Г	%Т
ITS2		13/7
12S рДНК		13/7
СОІ, всі позиції		-
1 позиція	-	-
2 позиція	-	-
3 позиція	-	-
ITS2+12S +COI		-
Примітка. OP/EP - штрафні очки за відкриття/подовження проміжку в вирівнюванні; # var – число варіабельних сайтів; # inf число сайтів, інформативних з огляду на застосування критерію ощадливості.

позиції не видалялися. Було вибрано вирівнювання з найвищою загальною підтримкою внутрішніх вузлів дерева, що слугує показником незначного конфлікту ознак. Основні властивості вирівняних послідовностей показано в таблиці 1.6.

Для філогеографічного аналізу було застосовано такі методи: Вирівнювання послідовностей проводилося за допомогою програми Muscle v3.7 (Edgar, 2004) при параметрах за замовчуванням і привело до однозначних вирівнювань з дуже невеликою кількістю коротких проміжків. Для кожного гена за допомогою програми Modelgenerator (Keane et al., 2006) була визначена найкраща модель еволюції.

Рис. 1.5. Вигляд агарозного гелю після того, як фрагменти ДНК були пофарбовані бромідом етидія. Останній (правий) стовпчик смужок – маркер розміру фрагментів. Менші фрагменти рухаються через гель швидше, ніж великі фрагменти. Усі зразки мають довжину 400 пар основ.

Рис. 1.6. Вигляд гелю для секвенування. Продукти реакції секвенування поміщено в стовпчики позначені літерами G, A, T та C залежно від того, який нуклеотид був представлений у дидеоксирибозній формі. Через те що найменші фрагменти рухаються найшвидше, можна прочитати послідовність, починаючи з нижньої частини гелю (за Freeland, 2006).

Рис. 1.7. Хроматограма, отримана в результаті автоматичного секвенування. Кожний кольоровий пик відбиває інтенсивність флюоресценції смужки в лазерному промені.

Дата добавления: 2015-05-23