Типы мутаций, используемые для получения продуцентов

По характеру локализации различают мутации:

• цитоплазматические;

• ядерные.

Материалом для селекции продуцентов служат ядерные мутации, затрагивающие хромосомные генетические детерминанты.

Ядерные мутации подразделяются:

• на генные (мутации на уровне отдельных генов);

• хромосомные (изменение структуры хромосом);

• геномные (изменение числа хромосом).

Генные мутации связаны с изменением последовательности нуклеотидов в пределах одного гена. В зависимости от механизма таких изменений различают:

• делеции (выпадение одного или нескольких оснований);

• вставки лишней пары нуклеотидов;

• транзиции (замена одних нуклеотидов на другие так, что это не меняет ориентации пурин­пиримидин в пределах пары);

• трансверсии (замены пар нуклеотидов, изменяющие ориентацию пурин­пиримидин).

Генные мутации связаны с явлением таутомеризации, которое влечет за собой изменение химических свойств.

Транзиции и трансверсии часто приводят к миссенс-мутациям (мутации с изменением смысла), в которых последовательность кодирующего триплета оснований после замены кодирует уже другую аминокислоту. Часть мутаций с заменой оснований приводит к возникновению нонсенсмутантов (бессмысленные мутации). Такие мутации приводят к образованию кодонов, не кодирующих никакой аминокислоты. Синтез белка в измененном кодоне прерывается, а образующиеся фрагменты белковой молекулы функционально неактивны из­за быстрого их протеолиза. Если мутация лишь частично нарушает функцию гена и новая аминокислота сходна с той, которая кодировалась геном дикого типа, то говорят о leaky-мутациях.

Делеции и вставки могут являться причиной frame-shift-мутаций (или мутаций со сдвигом рамки считывания), в результате чего синтезируется неактивный белок с измененной последовательностью аминокислот. При протяженных делециях, в результате которых удаляется значительная часть гена, синтезируются неактивные фрагменты белковых молекул.

Хромосомные мутации подразделяются:

• на делеции участков хромосомы;

• дефишенси (концевые нехватки, которые являются, по сути, частным случаем делеций);

• инсерции (вставки в определенные участки хромосомы);

• дупликации или амплификации (удвоения или умножения участков хромосомы);

• инверсии (изменение чередования генов в хромосоме);

• транслокации (обмен участками между негомологичными хромосомами);

• транспозиции (перемещение небольших участков хромосомы в пределах одной хромосомы или между разными хромосомами).

Хромосомные перестройки могут вызвать как утрату функций, так и возникновение новых. Результатом этого может явиться возникновение новых белков, уменьшение либо увеличение продукции определенных метаболитов.

В селекции продуцентов наибольший интерес представляют индуцированные мутанты.

По своей природе мутагены подразделяются на физические, химические и биологические.

Выбор мутагена определяется:

1) типом мутации, которую необходимо получить;

2) эффективностью мутагена в отношении данного микроорганизма.

Начиная мутагенез, нужно четко осознавать, какой именно тип мутанта соответствует поставленной задаче. Например, если нужно получить мутант с устойчивым генетическим маркером, с помощью которого можно будет идентифицировать мутант на всех этапах эксперимента, то следует отбирать штамм с неревертирующей мутацией, например, делецией. Если стоит задача выявить взаимосвязь между структурой какого­либо белка и его функцией, то наиболее подходящими будут точковые мутации.

Среди физических агентов используются УФ­облучение и радиация. УФ­облучение вызывает димеризацию пиримидинов и является мутагеном широкого спектра действия. При использовании этого мутагена приводит к образованию мутантов с транзициями, трансверсиями и делециями. Эффективность УФ­облучения довольно высока, однако высокая частота мутаций достигается за счет низкой выживаемости клеток. Кроме того,

такие мутанты хорошо восстанавливаются репарационными механизмами клеток. Рентгеновское излучение и техника быстрых нейтронов приводят к разрывам хромосом, вызывая делеции и инверсии. Мутагенный эффект этого метода довольно высок, однако его применение требует специального оборудования.

Более широкое применение нашли химические мутагены: аналоги оснований, азотистая кислота, нитрозогуанидин (НГ), этилметансульфонат (ЭМС), акридиновые красители и т. д. Аналоги оснований вызывают транзиции и трансверсии в результате ошибок репликации, однако эффективность их действия очень низка. Гидроксиламин и азотистая кислота, вызывающие дезаминирование нуклеотидов, способствуют возникновению делеций и транзиций. Акридиновые красители вызывают интеркаляцию

между основаниями во время репликации и способствуют возникновению мутаций со сдвигом рамки считывания. Наиболее эффективными из химических агентов является нитрозогуанидин (НГ), который вызывает алкилирование оснований в репликативной вилке и образует мутанты с транзициями, трансверсиями и делециями. Эффективность этого соединения очень высока. Этилметансульфонат, по сравнению с НГ, вызывает

меньше множественных мутаций и способствует алкилированию гуанина, в результате чего с высокой частотой образуются транзиции и трансверсии. При обработке химическими факторами следует соблюдать условия, способствующие максимальному проявлению мутагенной активности. Большую роль в этом играют рН раствора, время обработки, температурный режим. Так, НГ при обработке энтеробактерий, дрожжей наиболее эффективен при рН 6,0–6,5, у актиномицетов – при 9,0, у псевдомонад –при 5,5. Иногда химический агент более активен в газовой фазе, а не в жидкой среде. У актиномицетов и коринебактерий, обработанных парами диэтилсульфита, появляется в несколько раз больше морфологических мутаций, чем при обработке в водном растворе.

Доза воздействия физических мутагенов выражается в единицах излучения, соответствующих типу лучей. Доза химических мутагенов характеризуется концентрацией мутагена и временем экспозиции при соответствующей температуре.

При выборе дозы мутагена ориентируются на показатель выживаемости обрабатываемой культуры, который определяется процентным отношением числа колоний, выросших после посева мутагенизированной культуры к числу колоний, выросших после высева той же, но не обработанной мутагеном культуры клеток. Выживаемость зависит от дозы

мутагена, от индивидуальной чувствительности штамма к летальному эффекту мутагена. В селекции используются дозы, обеспечивающие выживаемость клеток в диапазоне от 0,1 до 50–80 %.

Значительно шире в современной селекции продуцентов применяются биологические агенты – транспозоны и гены­мутаторы. Гены­мутаторы образуются в результате мутаций, возникающих в генах, ответственных за репликацию ДНК либо участвующих в механизмах репарации.

Транспозоны способны встраиваться в различные участки хромосомы. Перемещение мобильных генетических элементов в пределах одного или нескольких репликонов может вызывать практически все типы хромосомных перестроек.

Внедрение транспозона в нуклеотидную последовательность какого­либо гена приводит к нарушению непрерывности этого гена и его инактивации. В результате такого встраивания получаются мутанты с двойным фенотипом:

• инактивация гена приводит к утрате функции, которую он контролирует;

• приобретение устойчивости к определенному антибиотику, которую кодирует ген транспозона.

Кроме того, включение и последующее вырезание транспозонов может являться причиной генных мутаций, происходящих в геноме. Включаясь перед генами, транспозоны могут вызвать «полярный эффект» (т. е. подавление экспрессии генов, расположенных вслед за внедрившимся элементом).

На основе применения транспозонов создаются методы транспозонного мутагенеза.

Чтобы осуществить транспозонный мутагенез необходимо иметь вектор для доставки транспозона. В качестве векторов обычно используют фаги или плазмиды, которые можно легко элиминировать из бактерииреципиента.

Транспозоны с использованием трансдуцирующих фагов применяются для осуществления локализованного мутагенеза in vivo. Фаголизат получают из клеток штамма, несущего транспозон, встроенный рядом с интересующим геном. Затем обрабатывают его мутагеном и используют для трансдукции какого­либо реципиентного штамма. Отбор трансдуктантов проводят на среде с соответствующим антибиотиком по приобретению устойчивости.

Важнейшей характеристикой полученных мутантов является их устойчивость. Некоторые мутанты способны ревертировать, причем с высокой частотой, что нужно учитывать при конструировании штамма­продуцента.

Дата добавления: 2015-05-07