Меченые серологические реакции

Реакция связывания комплемента Вассермана

Ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения антител, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является неспецифичность антигена: в качестве антигена употребляют липоидные экстракты из нормальных органов животных

Для постановки реакции Вассермана необходимо иметь сыворотку больного, диагностикумы перекрестнореагирующие антигены № 1, № 2, комплемент, гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, физиологический раствор.

Диагностикум № 1 — специфический, трепонемный.

Диагностикум № 2 — неспецифический, кардиолипиновый антиген, которые представляют собой высокоочищенные экстракты бычьего сердца, имеющие постоянный химический состав липоидов. Липоиды, экстрагированные из сердца, по химическому составу близки к липоидам бледной трепонемы, поэтому, хотя и не являются специфическими, но фиксируют антитела против спирохеты.

Указанные антигены выпускаются централизованно и в реакцию употребляются разведёнными согласно титру, указанному на этикетке.Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и с заведомо положительной сыворотками.

Постановка основного опыта

Вначале в 4 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 2 пробирки разливаются антигены (№ 1, № 2), в 3-ю пробирку — физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляется рабочая доза комплемента. После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 °С на 30 минут. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, в затем оставляют при комнатной температуре. На следующий день отмечают результат Степень интенсивности реакции оценивается, четыре плюса (++++), три (+++) два (++) и один (+) — в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне. Полный гемолиз обозначается (-) минусом. При резком расхождении результатов с различными антигенами опыт повторяют с новой порцией крови.

В настоящее время широко применяются серологические реакции, в которых участвуют меченые АГ-ы или АТ-ла. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы.

Они применяются:

1)для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъю-гированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями) антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченых диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ-м, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгиру-ют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:

1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);

2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;

3) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.

Компоненты непрямой РИФ:

1) исследуемый материал;

2) специфическая антисыворотка;

3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;

4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа. Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

В качестве метки используются радиоактивные изотопы. В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА.

1) Техника «жидкая фаза» (классический РИА). Недостаток этой техники постановки — необходимость специального разделения свободного и связанного меченого антигенов (или антител).

2) Техника «твёрдая фаза».

АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) — стенках полистироловой лунки или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последо-ватепьно сорбируются остальные компоненты ИК.В зависимости от характера реакции различают следующие методы:

1) Конкурентный метод — метод, основанный на конкуренции АГ.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ (исследуемый материал — кровь, мокрота и др.);

б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген, меченый радиоизотопом;

в) специфические АТ-ла известной концентрации, связанные на сорбенте;

г) стандартный АГ (контрольный);

д) буферный раствор.

Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ. Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ, Чем больше содержание исследуемого АГ, тем меньше меченого АГ связывается с АТ-м на поверхности сорбента. Концентрацию меченого АГ определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ в исследуемой пробе.

2) Неконкурентный метод.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ;

б) специфический АТ-а известной концентрации, связан-

ные на сорбенте;

в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые

радиоизотопом;

г) стандартный АГ;

д) буферный раствор.

К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.

3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) — наиболее распространённый метод.

Компоненты:

а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);

б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ-а);

в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченые радиоизотопами;

г) контрольные сыворотки (или АГ-ы);

д) буферные растворы.

Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твердофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ-АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).

Достоинства РИА:

1) высокая специфичность и чувствительность;

2) простота техники постановки;

3) точность количественной оценки результатов;

4) легко поддаётся автоматизации.

Недостаток: использование радиоактивных изотопов.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидаза является раствор ортофенилдиамина.Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. Сущность ИФА аналогична РИА. Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

- простота методов оценки реакции;

- стабильность конъюгатов;

- легко поддаётся автоматизации.

Однако, по сравнению с РИА, отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА: Конкурентный тип.

Назначение.

Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.

Компоненты:

1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;

2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;

3) коньюгат — мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,

4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

— положительная (сыворотка с НВе Ад);

— отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2) Инкубация 1 час при 37 «С.

3) Отмывание лунок.

4) Внесение конъюгата.

5) Инкубация 1 час при 37 «С.

6) Отмывание лунок.

7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.

Механизм

Реакция протекает в три фазы:

1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад — агл\ НВз АТ).

2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).

3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.

Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции — обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:

1) исследуемый материал — сыворотка крови;

2) синтетические пептиды, имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: др 120 и др 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТкАТ-м);

4) ОФД;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

- положительная;

- отрицательная.

Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток. 2} Инкубация 30 минут при 37 «С.

3) Отмывание.

4) Внесение антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом.

5) Инкубация 30 минут при 37 «С.

6) Отмывание.

7) Внесение ОФД. Механизм

Реакция протекает в 3 фазы:

1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (др 120 и др 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ {АТ к ВИЧ — АГ ВИЧ).

2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

Дата добавления: 2015-05-10