Определение фракционного состава липидов и состава жирных кислот пищевых продуктов

Важнейшей особенностью, определяющей характер биологического действия пищевого жира, является состав его жирных кислот. Определение жирокислотного состава возможно при наличии данных о фракционном составе липидов, так как жирные кислоты входят в состав ряда соединений (глицериды, свободные жирные кислоты, эфиры стеринов, фосфолипиды и др.) В каждой фракции соотношение жирных кислот и других компонентов различны. Отражая состав жирных кислот в суммарных липидах, в целях последующего количественного выражения этих данных в пересчете на продукт, необходимо знать парциальные доли каждой фракции. Задача фракционирования липидов на основные классы соединений в настоящее время, как правило, решается с помощью адсорбционной хроматографии на силикагеле.

Для количественного анализа липидов и жирных кислот используется ряд хроматографических методов: ГХ, ГЖХ, ВЭЖХ ЖХ, а также капиллярный электрофорез.

Так, для количественного определения отдельных фракций можно использовать адсорбционную хроматографию в тонких слоях силикагеля вместе с другими чувствительными методами анализа, например колориметрическим и спектрофотометрическим. После хроматографического разделения, обнаружения и идентификации компоненты элюируют растворителями из участков силикагеля, соответствующим отдельным фракциям, и определяют наиболее подходящим способом. Необходимо иметь в виду, что проведение хроматографического разделения таким способом всегда сопряжено с возможностью существенных потерь веществ на отдельных этапах.

В биохимии разделение и идентификацию липидов проводят по следующей схеме. Тонкослойная хроматография осуществляется на стеклянных пластинках, покрытых тонким слоем суспензии адсорбента, чаще всего силикагелем. После высыхания суспензии пластинки прокаливают в печи заданное время при определенной температуре. Далее на охлажденную «активированную» пластинку наносят смесь липидов в подходящем растворителе. После испарения растворителя край пластинки, ближайший к нанесенному пятну, погружают в смесь соответствующих растворителей, далее пластинку «проявляют» в замкнутой камере, пока растворитель не достигнет противоположного края пластинки. Затем пластинку высушивают для удаления растворителя и определяют положение пятен либо путем их «обугливания» (обработка серной кислотой с последующим нагреванием), либо по флуоресценции (после обработки дихлорфлуоресцином), либо путем обработки парами йода.

Существует следующая методика денситометрического определения индивидуальных классов липидов, в том числе стеринов, на основе хроматографии в тонком слое силикагеля. Принцип метода состоит в том, что при анализе к силикагелю добавляют краситель метиловый красный. Липиды проявляются в виде пурпурных пятен на розовом, а затем на желтом фоне. После обесцвечивания фона парами аммиака хроматограмму фотографируют, а фотокопии денситометрируют, сравнивая оптическую плотность изучаемых фракций с оптической плотностью стандарта.

Денситометрия – измерение оптической плотности светопоглощающих сред, главным образом, проявленных фотографических слоев.

В процессе получения липидов важно не допустить их окисления, так как последние имеют иную хроматографическую подвижность, чем нативные липиды, и на хроматограммах будут присутствовать дополнительные пятна и «хвосты». Во избежание окисления липиды защищают от действия прямого солнечного света, экстракт хранят в холодильнике в плотно закрытых колбах с притертыми пробками. Растворители отгоняют в токе азота или под вакуумом, допуская лишь слабое (до температуры 40–50ºС) нагревание. Выделенные для весового определения и подсушенные на воздухе липиды для фракционирования обычно не используют.

Для количественного определения жирных кислот может быть использован колориметрический метод. Готовят метанольный раствор выделенных жирных кислот и подкисляют серной кислотой. В течение 15 минут проходит метанолиз (образование метиловых эфиров жирных кислот). Затем к полученному раствору добавляют растворы щелочи и гидроксиламина. Происходит образование гидроксамовых кислот. Эти кислоты дают с ионами Fe³⁺ интенсивно окрашенные соли. С этой целью к полученному раствору прибавляют раствор соляной кислоты и хлорного железа и раствор приобретает розовато-желтую окраску. Полученный раствор фотометрирут и по калибровочному графику оценивают содержание жирных кислот.

При действии гидроксиламина на сложные эфиры, ангидриды, хлорангидриды, амиды карбоновых кислот образуются гидроксамовые кислоты:

рН>11,5 10–15 мин

Эти кислоты дают с Fe (3+) интенсивно окрашенные соли. В зависимости от соотношения количества железа и кислоты и от рН раствора могут получаться разные продукты реакции с различной окраской:

Красно-бурая Вишневая Красно-фиолетовая

435–440 нм 470–495 нм 520–540 нм

Для качественного и количественного анализа жирных кислот также может быть использован метод тонкослойной хроматографии. Метод применяется и для препаративного разделения. Для хроматографирования высших жирных кислот и их производных применяют незакрепленный слой силикагеля и окиси алюминия, а также слой силикагель-гипс. Колоночный способ хроматографирования используется с целью препаративного разделения.

При использовании ТСХ детектирование осуществляют как и в бумажной хроматографии, используя спецефические реагенты: концентрированная серная кислота, смесь азотной и фосфорной кислот. После разделения пластинки опрыскивают кислотой и нагревают в течение 10–15 мин при 80–120ºС. Существует также способ проявки в стеклянном сосуде с кристаллами йода. (Чувствительность 1 мкг липидов.)

Для проведения количественного анализа после разделения пробы в тонком слое снимают слой силикагеля соответственно локализации жирной кислоты или любого вещества липидной природы, проводят элюирование соответствующими растворителями, удаляют силикагель центрифугированием и элюат анализируют любыми, подходящими для этой цели химическими или физическими методами. Определение расположения компонентов на хроматограмме проводят на основании сравнения с параллельно разделенной такой же пробой, обработанной соответствующими реагентами.

Количественный анализ можно вести фотометрическим методом путем измерения интенсивности окраски пятен фотометром в отраженном свете. Полученные данные наносят на график и сравнивают с данными комбинированной кривой, построенной по стандартным препаратам. Определяют концентрации веществ также по площади пятна (полуколичественный метод).

Однако для получения данных по жирнокислотному составу пищевых продуктов чаще всего использовался метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Для анализа используют не сами жирные кислоты, а их производные – метиловые эфиры. Этим достигают высокую эффективность разделения при более низких температурах и более коротком времени анализа. При анализе должен быть использован метод, обеспечивающий количественный выход при превращении жирных кислот в метиловые эфиры. В литературе описан ряд методов метилирования. Чаще всего метанолиз глицеридов ведут в закрытой системе в метанольном растворе KOH. Используют также нагревание при 45–50ºС в 5%-ном растворе HСl в абсолютном метаноле или 5–10%-ном растворе толуолсульфокислоты в абсолютном метаноле. Выбор метода зависит от анализируемого материала.

ГЖХ приводит к физическому разделению пропускаемой газовой фазы путем адсорбции ее компонентов на стационарной фазе, состоящей из инертного твердого носителя, например силикагеля, или инертных гранул размолотого жаропрочного кирпича, покрытых нелетучей жидкостью (например, смазочным жиром или силиконовым маслом). На практике применяют металлические или стеклянные колонки, заполненные указанным сорбентом; смесь метиловых эфиров жирных кислот в газообразном состоянии пропускают через колонку, по всей длине которой поддерживается температура 170–225ºС. Постоянный поток инертного газа – аргона или гелия – увлекает за собой газообразные эфиры. В соответствии с общими принципами хроматографии разделение эфиров жирных кислот основано на различном сродстве компонентов газовой смеси к материалу стационарной фазы. Газы, имеющие большее сродство к стационарной фазе, движутся вдоль колонки медленнее и появляются на выходе из колонки позднее, чем те, которые имеют относительно меньшее сродство. По мере выхода из колонки индивидуальных эфиров жирных кислот они автоматически регистрируются физическими или химическими методами в виде серии пиков, распределенных во времени в соответствии с эффективностью их удерживания стационарной фазой. Площадь под пиком пропорциональна концентрации каждого из компонентов смеси. Идентификация каждого компонента производится путем сравнения с хроматограммой стандартной газовой смеси известного состава.

Преимущества газовой хроматографии состоят в высокой чувствительности, позволяющей разделять очень малые количества смеси, и возможности многократного использования колонки. С помощью этого метода в составе природных жиров обнаружено большое число ранее не идентифицированных жирных кислот.

Газожидкостная хроматография метиловых эфиров жирных кислот может быть проведена как на набивных, так и на капиллярных колонках при условии получения хроматограмм, позволяющих осуществить количественный расчет содержания отдельных компонентов в смеси. Температура колонок 150–300ºС. В качестве газа-носителя используют азот, гелий или аргон. Для детектирования метиловых эфиров используют катарометр, ионизационный или пламенно-ионизационный детектор.

Хроматографическое разделение жирных кислот может быть проведено на полярных и неполярных жидких фазах.

В качестве неполярной фазы наиболее часто применяется высоковакуумная смазка апьезон (L или M), нанесенная на носитель. Эти смазки выдерживают температуру до 300ºС без заметного разложения или потери. Эфиры насыщенных жирных кислот элюирутся с апьезона в соответствии с возрастанием числа атомов углерода. Причем, метильная группа в боковой цепи уменьшает Ван-дер-Ваальсовы силы взаимодействия между растворенным веществом и распределяющей жидкостью, и такое соединение движется быстрее соответствующей насыщенной кислоты с прямой цепью.

Введение двойной связи в молекулу растворенного вещества повышает его полярность и вместе с тем уменьшает его сродство к неполярной неподвижной фазе. В результате чего ненасыщенное соединение движется быстрее аналогичного насыщенного соединения. Например, удерживаемый объем олеиновой кислоты на апьезоне М при 197º составляет 0,815 по сравнению с 1,00 для стеариновой кислоты. Коэффициент разделения составляет 1,23, что позволяет легко разделить их на этой жидкости. Введение второй изолированной двойной связи, как, например, в линолевой кислоте, еще больше увеличивает скорость движения по колонке. При этом удерживаемый объем составляет 0,792 от удерживаемого объема стеариновой кислоты. Коэффициент разделения олеиновой и линолевой кислот равен всего лишь 1,03. Добавление третьей изолированной двойной связи, как в линоленовой кислоте, не приводит к дальнейшему изменению удерживаемого объема, так что линоленовая и линолевая кислоты элюируются одним пиком. Тетраены, при разделении жирных кислот на неполярных фазах, выходят раньше соответствующих сложных эфиров с коэффициентом разделения 0,6, но не отделяются от пентаенов, а гексаены дают пик перед общим пиком тетраенов и пентаенов. Сопряжение двойных связей в полиеновых эфирах приводит к более быстрому их движению по сравнению с соответствующими изомерами с несопряженными связями.

Пики, соответствующие ненасыщенным соединениям, можно определить, проводя бромирование части смеси сложных эфиров и повторный хроматографический анализ. Бромированные эфиры недостаточно летучи, чтобы элюироваться из колонки, и поэтому пики, соответствующие ненасыщенным эфирам, полностью исключаются. Другой метод удаления двойных связей состоит в каталитическом гидрировании пробы перед повторным хроматографическим анализом. При этом удается не только исключить пики, обусловленные ненасыщенными соединениями, но и разделить компоненты смеси по числу атомов углерода, поскольку пики ненасыщенных соединений суммируются с соответствующими пиками насыщенных соединений. Таким образом, неполярные неподвижные фазы, такие, как апьезоны, позволяют разделить гомологические ряды соединений по числу атомов углерода, а при сочетании с бромированием и гидрированием – получать сведения о распределении насыщенных соединений. Кроме того, ГЖХ на неполярных неподвижных фазах дает также сведения о положении двойных связей и ориентации относительно этих связей. (Транс-изомеры элюируются медленнее соответствующих цис-изомеров).

При оптимальных условиях можно достигуть хорошего отделения метилстеарата от метилолеата и частичного разделения метилолеата и метиллинолеата, используя в качестве неподвижной распределительной жидкости апьезон L. На этой жидкости, однако, ни разу не удалось разделить метиллинолеат и метиллиноленат. Для этого в качестве неподвижной фазы следует использовать полярную жидкость. До сих пор для этих целей лучше всего подходили полиэфиры, получаемые конденсацией двухосновных кислот с двухатомными спиртами. Например, продукт конденсации этиленгликоля с янтарной кислотой:

(-СН₂СН₂-О-СО-СН₂СН₂-СО-)_n

Полиэфиры отличаются от апьезонов в следующих отношениях по способности разделять метиловые эфироы жирных кислот:

-Полиэфиры значительно более полярны, поэтому прохождение всех эфиров жирных кислот через колонку, заполненную ими, происходит значительно быстрее при соответствующих температурах благодаря уменьшению ван-дер-ваальсовых сил взаимодействия между растворителем и растворенным веществом. Это позволяет разделять пробы за более короткий промежуток времени. Лучше, однако, уменьшить температуру колонки и элюировать высшие эфиры за приемлемое время.

-При увеличении длины цепи на одну группу СН₂ удерживаемый объем увеличивается в 1,46 раза по сравнению с коэффициентом 1,56 для апьезона L при 200ºС. Таким образом, полиэфиры позволяют разделять члены гомологических рядов по температурам кипения, но для этой цели они не столь эффективны, как неполярные жидкости.

-Ненасыщенные соединения на колонках, заполненных полиэфиром, удерживаются дольше, чем их насыщенные аналоги, благодаря более сильному взаимодействию растворенного вещества с растворителем – между более полярным растворенным веществом и полиэфиром. Следовательно, удерживаемые объемы при элюировании с полиэфира уменьшаются в следующем порядке: триены > диены > моноены > насыщенные соединения. Для сравнения можно указать, что удерживаемые объемы на апьезоне уменьшаются в следующем порядке: насыщенные соединения > моноены >> диены = триены. Следует отметить, что здесь наблюдается обратный порядок элюирования, а также, что диены и триены можно разделять на полиэфирах, но нельзя разделять на апьезонах. Кроме того, гексаены, пентаены и тетраены можно разделять на полиэфирах, тогда как на апьезоновой смазке некоторые пары этих соединений, например тетраены и пентаены, имеют одинаковые удерживаемые объемы.

-На колонке с полиэфиром не происходит изменения удерживаемого объема при смещении двойной связи в углеводородной цепи. Точно также не существует различия в величине удерживаемого объема цис- и транс- изомеров.

В качестве полярных жидких фаз используют полиэтиленгликольадипат, полипропиленгликольадипат (реоплекс 400), бутандиолсукцинат и др. Каждый материал имеет свое фирменное название. При использовании капиллярных колонок рекомендуются полярные силиконовые фазы. Выбор фаз определяется конкретными задачами каждого исследования.

Обобщая выше сказанное следует еще раз отметить, что колонки с апьезоном и полиэфиром дополняют, а не заменяют друг друга при анализе и идентификации эфиров жирных кислот. Апьезоны и аналогичнсые жидкости обеспечивают хорошее разделение по температурам кипения, а кроме того, позволяют различать цис- и транс- конфигурации у двойных связей и установить положения двойных связей в углеводородной цепи. Полиэфиры обеспечивают разделение по числу атомов углерода, но их основной задачей является разделение насыщенных эфиров, моноенов, диенов, триенов и т.д. Ненасыщенные соединения удерживаются набивкой сильнее насыщенных соединений с тем же числом атомов углерода в молекуле. Данные, полученные на двух колонках, объединяют для идентификации эфиров жирных кислот.

Для количественной характеристики содержания жирных кислот определяют процентное отношение площади соответствующего пика хроматограммы к сумме- площадей пиков. Данные о составе метиловых эфиров жирных кислот используют затем для расчета содержания каждой жирной кислоты (в г на 100 г продукта). Расчет возможен, если имеются данные о фракционном составе изучаемого жира.

Газораспределительная хроматография нашла широкое применение при массовых анализах жиров в промышленности, особенно при изучении состава природных жиров и масел, а именно: масла орехов, масла семян и плодов различных растений, тюленьего жира, жира печени трески, рыбьего жира, жиров говяжьего, телячьего, бараньего, костного свинного, жира коровьего молока, сливочного масла, кислот, образующихся при окисилении сливочного масла и других продуктов питания.

Стерины и фосфолипиды обладают выраженной физиологической активностью и должны учитываться при расчете рационов питания. Как правило определяют содержание холестерина в продукта животного происхождения и b-ситостерина в продуктах растительного происхождения. И в тех и в других продуктах присутствует ряд других стеринов, но в меньших количествах и физиологическая роль этих компонентов пока не выяснена.

Детальный анализ стериновых фракций может быть проведен с помощью ГЖХ или хромато-масс-спектроскопии. Для этого необходимо предварительно выделить фракции неомыляемых веществ путем щелочного гидролиза. Общее содержание стеринов определяют фотометрически на основе цветных реакций. Для определения стеринов в пищевых продуктах, например, подходит реакция с хлорным железом (аналогично определению жирных кислот). Однако такое определение имеет только теоретический интерес.

Определение содержания фосфолипидов осуществляется на основе анализа содержания липидного фосфора, т.е. фосфора, определяемого в экстракте липидов. Для этих целей можно использовать различные методы, так как во всех случаях липиды подвергаются минерализации. Так, определение лецитина можно провести следующим образом. Исследуемый материал экстрагируют этиловым спиртом и после отгона последнего остаток экстрагируют эфиром; после отгона эфира во вновь полученном остатке определяют содержание фосфора после минерализации (методы определения фосфора описаны в разделе, посвященном минеральным веществам). Полученный результат пересчитывают на лецитин.

Контрольные вопросы:

1. Какие вещества называют липидами?

2. Какие функции выполняют липиды в организме человека?

1. На какие группы делятся липиды по классификации Блора? Приведите примеры основых групп липидов?
2. Какие существуют способы извлечения липидов из продуктов питания?
3. Какие химические характеристики жиров вы знаете и как их определяют?
4. Что такое химическое и биохимическое прогоркание?
5. Какие функции в организме выполняют насыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты?
6. Как определяют количество и фракционный состав липидов продуктов питания?
7. Как определяют состав жирных кислот?

§ 2.6. Витамины

Витамины представляют собой низкомолекулярные органические пищевые вещества различной природы, которые требуются для нормального метаболизма в малых дозах и не могут синтезироваться организмом в адекватных количествах. Это важнейший класс незаменимых пищевых веществ, которые должны поступать с пищей в качестве ее обязательного компонента.

Витамины в организме выполняют специфические биохимические функции и играют огромную роль в жизнедеятельности человека. Они нормализуют обмен веществ, катализируют многие обменные процессы, участвуют в образовании ферментов, способствуют лучшему усвоению пищевых веществ. В организме они, как правило, не синтезируются или синтезируются в недостаточном количестве. Отсутствие или недостаток в организме витаминов вызывает болезни недостаточности: гиповитаминозы (болезни в результате длительного недостатка) и авитаминозы (болезни в результате отсутствия или резко выраженного глубокого дефицита витаминов). Основная причина нехватки витаминов в организме человека – недостаточное поступление их с пищей. При приеме витаминов в количестве, значительно превышающем физиологические нормы, могут развиваться гипервитаминозы, что особенно характерно для жирорастворимых витаминов.

В настоящее время известно более тринадцати соединений, относящихся к витаминам. Различают собственно витамины и витаминоподобные соединения. К витаминоподобным относят соединения, полная незаменимость которых не всегда доказана. К ним относятся биофлавоноиды (витамин Р), пангамовая кислота (витамин В₁₅), парааминобензойная кислота (витамин Н₁), оротовая кислота (В₁₃), холин (витамин В₄), инозит (витамин Н₃), липоевая кислота и др. Витаминоподобные соединения могут быть отнесены к важным биологически активным соединениям пищи, выполняющим разнообразные функции. В отдельных продуктах содержатся провитамины – соединения, способные превращаться в организме человека в витамины, например b-каротин, являющийся провитамином витамина А.

По способности к растворению витамины разделяются на водо- (С, В, РР) и жиро- (А, Д, Е, К) растворимые (хорошо растворимые в жирах и растворителях жиров).

Существует группа соединений, близких по строению к витаминам, которые могут занять их место в ферментных системах, но не могут выполнять их функции. Такие соединения получили название антивитаминов.

Дата добавления: 2015-05-29