Практичне заняття №12

· Які органи імунної системи відносяться до центральних та периферичних, їх функції?

· Які клітини відносяться до імунокомпетентних, їх функції?

· Які клітини приймають участь у синтезі антитіл, характер їх кооперації?

· Дати визначення поняттям: антигени, антигенність.

· Які антигени має бактерія (на прикладі E.coli)?

· Що таке серологічні реакції, відмінності простих та складних СР?

· З якою метою може бути поставлена серологічна реакція?

· Які етапи включає в себе отримання імунних діагностичних сироваток?

У захисті організму від чужорідних агентів вирішальну роль відіграють імунологічні механізми, які здійснюються антитілами (імуноглобулінами) та імунокомпетентними клітинами (лімфоцитами). В основі імунологічних механізмів є специфічна взаємодія антигену, що потрапив в організм, та антитіла, що утворилось у відповідь на потрапляння антигену. На використанні принципу взаємодії антигену та антитіла базуються всі імунологічні діагностичні реакції, які названі серологічними, оскільки антитіла знаходяться в сироватці крові. Застосування серологічних реакцій з метою серодіагностики інфекційного захворювання та з метою сероідентифікації збудників, що виділені від хворого, є необхідним для встановлення заключного діагнозу інфекційного захворювання. На занятті студентам надається можливість оволодіти методикою постановки основних серологічних реакцій (реакція аглютинації, реакція пасивної гемаглютинації, реакція гемолізу). Розуміння ролі антитілоутворення у формуванні імунної відповіді є необхідним підгрунтям для формування уявлення про складний механізм функціонування імунної системи та її ролі у розвитку імунозалежних патологій. Вміння обирати потрібні для діагностики інфекційного захворювання серологічні реакції, ставити їх та інтерпретувати отримані результати є важливим для формування у студентів клінічного мислення і розуміння суті патологічного процесу при інфекційних хворобах.

· Аналізувати механізм взаємодії антитіл з антигенами

· Знати закономірності серологічних реакцій

· Інтерпретувати участь клітин імунної системи в імунній відповіді і фази імунної відповіді

· Вміти проводити облік результатів розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації

· Оволодіти методикою постановки реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної діагностики (реакція Відаля)

· Оволодіти методикою постановки реакції імунного гемолізу

· Засвоїти методику постановки реакції непрямої гемаглютинації

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №10.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1.Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення

Реакції лізису	Реакцією лізису називають розчинення антигену під дією антитіла у присутності комплементу. Свіжевиділена з організму людини імунна сироватка здатна до лізису, бо містить антитіла та комплемент. Якщо ж сироватка прогрівалась чи довго зберігалась, то лізис відбувається лише за умови додавання комплементу.
Реакція імунного гемолізу	Реакція імунного гемолізу базується на тому, що при імунізації тварин (частіше кролів еритроцитами барана) в сироватці крові з’являються специфічні захисні антитіла – гемолізини, які здатні в присутності комплементу порушувати зв’язок гемоглобіну зі стромою еритроцитів та викликати гемоліз (вихід гемоглобіну назовні еритроцита). Імунна сироватка, яка містить гемолізини, має назву гемолітичної сироватки. Такі сироватки випускають Інститути бактеріальних препаратів.
Сила гемолітичної сироватки	Сила гемолітичної сироватки визначається в титрах – це максимальне її розведення в об’ємі 0,5 мл, при якому спостерігається повний гемоліз 0,5 мл 3% зависі баранячих еритроцитів у присутності 0,5 мл комплементу, розведеного 1:10 та витримуванні пробірок впродовж години при 37⁰ С.
Реакція непрямої гемаглютинації	Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) полягає в тому, що еритроцити барана чи іншого виду тварин, маючи здатність адсорбувати на собі антигени, стають “чутливими” (сенсибілізованими) до відповідної імуної сироватки. Під впливом специфічних антитіл сенсибілізовані еритроцити склеюються та випадають в осад, утворюючи на дні пробірки (або лунки) гемаглютинат. Відрізняючись високою специфічністю та чутливістю, РНГА дозволяє виявляти мінімальну кількість антитіл.
Система комплементу	Група сироваткових білків, які в процесі їх активації перетворюються в ефекторні молекули, що призводять до розвитку запалення (С3а, С5а, С4а), фагоцитозу (С3b)та руйнуванню клітин (С6-9). Таким чином, білки комплементу приймають участь у розвитку запальних реакцій, реакцій опсонізації та лізису клітинних мембран.

Діагностикуми	Діагностикуми – стандартні антигени, в ролі яких можуть бути суспензії інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині. Діагностикуми застосовуються при серологічній діагностиці інфекційних захворювань.

· Діагностикуми, їх характеристика, принципи отримання і практичне використання.

· Трьохкомпонентні та багатокомпонентні серологічні реакції (імунного лізису, реакція зв’язування комплементу, опсонофагоцитарна, непрямої аглютинації), їх суть, практичне використання.

· Система комплементу, шляхи її активації, біологічне значення.

· Реакція імунного гемолізу, механізм, практичне використання.

· Оцінка результатів серологічних реакцій і висновки.

· Реакції бактеріолізу, цитолізу, їх механізм та практичне використання.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

· Провести облік розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.

· Поставити реакцію Відаля для серологічної діагностики черевного тифу.

· Здійснити облік результатів РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу, зробити висновок

· Провести облік результатів реакції імунного гемолізу, зробити висновок.

На практичному занятті студенти знайомляться зі складними серологічними реакціями, розглядають особливості постановки та компоненти реакції аглютинації і методику постановки реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з метою серологічної діагностики інфекційних захворювань. Студенти проводять облік реакції аглютинації, поставленої з метою ідентифікації культури бактерій; ставлять реакцію Відаля для діагностики черевного тифу; здійснюють облік РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу; ставлять реакцію імунного гемолізу; вивчають зразки діагностикумів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

5.1. Облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.

Студенти проводять остаточний облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою ідентифікації культури бактерій. Ступінь позитивної реакції аглютинації позначається плюсами:

++++ - повна аглютинація, рідина прозора, а на дні значна кількість білого осаду;

- - рідина рівномірно мутна, як в контролі антигену; осад відсутній. Результат в цьому випадку вважають негативним.

Відповідність між видом мікроба і діагностичною аглютинуючою сироваткою вважається достовірною при умові чітко вираженої реакції аглютинації в пробірках з розведенням сироватки в межах титру, але не менше 2/3 її титру при відсутності осаду в контролях сироватки і культури.

5.2. Постановка реакції аглютинації з метою виявлення антитіл в сироватці хворого з підозрою на черевний тиф та паратифи А та В.

Для проведення реакції беруть у хворого кров, одержують з неї сироватку і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду від 1:50 до 1:800 за схемою. Як антиген в цій реакції використовують діагностикуми – суспензії із відомих убитих мікроорганізмів – черевного тифу та паратифів А та В.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦІЇ АГЛЮТИНАЦІЇ З МЕТОЮ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ В СИРОВАТЦІ КРОВІ ХВОРОГО

№ пробірки Інгредієнти (в мл)	Дослідні	Контрольні

Фізіологічний розчин	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	---
Сироватка крові хворого в розведенні 1:25 (0,1 мл с-ки + 2,4 мл фіз.розчину)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	В дез. Р-н. ---	1,0
Діагностикум	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	---
Отримані розведення сироватки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	КД	КС

Штатив з пробірками поміщають в термостат при 37⁰С. Попередній облік реакції проводять через 2 години, а остаточний – через 18-20 годин.

5.3. Принцип постановки та облік результатів реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), поставленої з метою серологічної діагностики.

Суть реакції непрямої гемаглютинації полягає в тому, що еритроцити, на поверхні яких адсорбовані будь-які розчинні антигени, набувають здатності аглютинуватись при взаємодії з антитілами, специфічними до адсорбованого антигену. Еритроцити, що сенсибілізовані антигенами, називаються еритроцитарними діагностикумами. Найчастіше використовують еритроцити барана, яким властива висока адсорбуюча активність. Реакцію ставлять за такою схемою: в пробірках або лунках прогріту впродовж 30 хв. при 58⁰ С досліджувану сироватку розводять послідовно від 1:10 до 1:320 в об’ємі 0,25 мл та додають по 2 краплі еритроцитарного діагностикуму. Реакцію супроводжують контролями: на спонтанну аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів, контроль з нормальними еритроцитами, а також контролі діагностикумів з завідомо позитивною та негативною сироватками. Після легкого струшування пробірки або лунки витримують в термостаті 30-45 хв. при 37⁰ С. Облік результатів реакції здійснюють після того, коли випадуть в осад еритроцити у відповідних контрольних пробірках. Достовірними результатами слід вважати відсутність гемаглютинації в контролях з нормальними, сенсибілізованими еритроцитами, з завідомо негативною сироваткою і наявність гемаглютинації і з завідомо позитивною сироваткою. Гемаглютинація в дослідних пробірках при відповідних контролях свідчить про наявність специфічних антитіл в досліджуваній сироватці. Результати оцінюють за зовнішнім виглядом осаду еритроцитів в лунках. В позитивному випадку (+) еритроцити рівномірно у вигляді “парасольки” покривають майже все дно пробірки або лунки. При негативному результаті (-) еритроцити осідають у формі компактного комочка – “гудзика”.

Імунний лізис – це розчинення клітин (антигенів) під дією специфічних антитіл (лізінів) в присутності комплементу. В залежності від антигенів, що беруть участь в реакції лізису, вона одержала назву бактеріолізу, спірохетолізу, гемолізу тощо. Найчастіше використовується в лабораторній практиці реакція гемолізу як індикаторна система в реакції зв’язування комплементу. Для постановки реакції потрібні: 1) антиген – 3% суспензія еритроцитів; 2) антитіло – гемолітична сироватка проти еритроцитів барана; 3) комплемент – сироватка морської свинки, розведена 1:10; 4) ізотонічний розчин хлориду натрію.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ДОСЛІДУ РЕАКЦІЇ ГЕМОЛІЗУ

№ пробірок Інгредієнти (в мл)	Дослід	Контролі

Антитіло – гемолітична сироватка	0,5	---	0,5	---
Антиген – 3% завись еритроцитів барана	0,5	0,5	0,5	0,5
Комплемент (1:10)	0,5	0,5	---	---
Фізіологічний розчин	---	0,5	0,5	1,0

Всі пробірки ставлять в термостат на 30-45 хвилин при 37⁰ С, після чого проводять облік реакції. В даному випадку в дослідній пробірці повинен наступити гемоліз в результаті специфічної реакції між гемолітичною сироваткою і еритроцитами в присутності комплементу. В контрольних пробірках не повинно бути гемолізу, тому що в одній із них відсутній комплемент (контроль гемолітичної сироватки), в другій відсутня гемолітична сироватка (контроль комплементу), а в третій відсутні комплемент та гемолітична сироватка (контроль еритроцитів).