I. Культуры клеток

Методы культивирования вирусов

Общая и частная вирусология

Вирусы - это облигатные внутриклеточные паразиты, не способные

размножаться ни в одной из бесклеточных сред.

Для культивирования вирусов используются следующие живые объекты:

1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные

животные.

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые

можно разделить на первичные (первично трипсинизированные) и

перевиваемые (штаммы клеток и линии).

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные и эпителиальные.

Первичные культуры клеток - это клетки различного типа. Получают их следующим образом: ткань (эмбриональную или из взрослых организмов) механически измельчают и обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином). После отмывки и подсчета клеток суспензию разбавляют питательной средой и дают возможность клеткам прикрепиться к плоской поверхности стеклянных или пластмассовых сосудов. В результате деления на поверхности сосудов образуется сплошной монослой клеток. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердой поверхностью, на которой они выращивались, что ведет их к гибели.

Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов широко используются как в лабораторных исследованиях, так и для производства вирусных вакцин.

Перевиваемые штаммы клеток (диплоидные клетки) - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов, полученные из эмбрионов человека, широко используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий являются первичные клеточные культуры, отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака легкого в костный мозг; RH - из почки человека; ВНК-21 -из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки и

ДР.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток B уже сформированном монослое при размножении в клетке вируса

Широкое применение находят синтетические стандартные среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные Среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. гНеотье1лемы компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживают, Сред сыворотка не входит.

Культивирование вирусов на культурах клеток. При выделение, вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала предварительно обработанного антибиотиками. После 30-60 мин контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0-1, g мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить: 1) развитие специфической дегенерации клеток - цитопатическое действие вируса (ЦПД) которое имеет три основных типа (кругло - или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских

клеток, клеток - симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих 3 нескольких слоев клеток);

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемагглютинации (ГА);

4) положительная реакция гемадсорбции;

5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного. При наличии вируса в клетках образуются бесцветные, зоны ("бляшки") на розовом фоне агара.

6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдаем ЦПД.

II. Куриные эмбрионы (7-12-дневного возраста). Используют для вирусологических исследований.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При

овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый

рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка или

место расположения эмбриона, или границы желточного мешка.

Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными

инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным

пространством йодом и спиртом.

Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение

вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную

полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от

биологических свойств изучаемого вируса.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона,

положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или

амниотической жидкостью, по фокусным поражениям, ("бляшкам"), на

хорион-аллантоисной оболочке.

III. Лабораторные животные. Могут быть использованы для выделения

вирусов из инфекционного материала, когда невозможно применить более

удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут

преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок,

крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса:

пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные -

интрацеребрально, дерматотропные - на кожу.

Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных,

их гибели, патоморфологических изменений в тканях и органах, а также на

положительной реакции гемагглютинации с экстрактами из органов.

Дата добавления: 2015-07-02