Иммобилизованные ферменты

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым в воде носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства. При этом нерастворимый носитель представляет собой частицу (гранулу, нить, пространственную конструкцию с развитой поверхностью) размер которой на много порядков больше размера самой крупной молекулы фермента. Такую частицу можно видеть невооруженным глазом, держать в руках, загружать в различные устройства. Таким образом ферментативный катализ из гомогенного процесса, протекающего во всем объеме реакционной среды, превращается в гетерогенный, протекающий на поверхности такого носителя.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что фермент сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую ак­тивность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осу­ществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем без потери активности иммобилизуемого фермента.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул или клеток.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего, такие фер­менты, представляя собой гетерогенные катализаторы, которые легко от­деляются от реакционной среды и могут использоваться многократ­но без потери активности, обеспечивая таким образом непрерывность каталитического процесса при сохранении асептических условий. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: суб­стратной специфичности, устойчивости, зависимости активнос­ти от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговеч­ны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным фер­ментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффектив-ность и конкурентоспособность технологий, использу­ющих иммобилизованные ферменты.

1. Носители для иммобилизованных ферментов. Считается, что идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основ­ными свойствами: нерастворимостью в воде; высокой химической и био­логической стойкостью; значительной гидрофильностью (смачиваемостью); доста­точной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционно-способную форму). Кроме того материал носителя должен быть нетоксичным для человека и микроорганизмов-продуцентов, а так же не влиять на физико-химические свойства реакционной среды (значение рН, концентрацию определенных ионов), которые могут повлиять на активность фермента.

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечислен­ным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носи­телей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неоргани-ческие материалы.

Органические полимерные носители. Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органичес­кой природы. Существующие органические полимерные носите­ли можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов орга­нических полимерных носителей подразделяется на группы в за­висимости от их строения. Среди природных полимеров выделя­ют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических- полиметиленовые, полиамидные и полиэфир­ные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недо­статкам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто исполь­зуют целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для прида­ния химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сет­чатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) син­тезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий по­вышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных коли­чествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значи­тельных количествах, дешевы и имеют большое число функцио­нальных групп для связывания фермента. Белки способны к био­деградации, что очень важно при конструировании иммобилизо­ванных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

Синтетические полимерные носители. Благодаря разнообразию и доступности материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации. К ним относятся полимеры на ос­нове стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; по­лиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтети­ческих полимерных носителей обладают механической прочнос­тью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функци­ональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммоби­лизации ферментов.

Носители неорганической природы. В качестве носителей наи­более часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды ме­таллов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гаф­ния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации, механическая и химическая прочность. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Таким образом, к настоящему времени создано огромное число разнооб­разных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каж­дого индивидуального фермента, используемого в конкретном тех­нологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты, как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

2.Методы иммобилизации ферментов. Существуют два принципиально различных метода иммобили­зации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

Рис.3. Методы иммобилизации ферментов (ф-молекула фермента)

Физические методы иммобилизации ферментов реализуются либо посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, либо путем включения их в поры поперечносшитого геля, в по­лупроницаемые структуры или различные двухфазные системы.

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При ад­сорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нель-сон, Э.Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобили­зованных ферментов с использованием главным образом таких но­сителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается край­ней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешива­нии, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, напри­мер, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Актив­ность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невы­сокую прочность связывания фермента с носителем. При измене­нии условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гид­рофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поли-винилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты. Многие субстраты с большим размером молекул так же могут не проникнуть в поры такого геля.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помо­щью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолеку­лярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Первый способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое - в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина-1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая фаза):

_-HCl

H₂N-(CH₂)₆-NH₂ + СlOС-(СН₂)₈-СОС1 → HN-(CH₂)₆-NH - СО-(СН₂)₈-СО-

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования - простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильт­рования). Особенно существенно, что методом микрокапсулиро­вания могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

Другие приемы иммобилизации ферментов, основанные на физических методах, менее распространены по сравнению с рассмотренными выше.

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью специальной вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность —СН₂—NH—(СН₂)₅—СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями.

Рис.4. Схема иммобилизации фермента химическим методом

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента уча­ствовали функциональные группы, не существенные для его каталитической функции (функциональные группы активного центра). Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента. Если это условие не соблюдается, то химическая иммобилизация может привести к полной потере ферментативной активности.

Число методических приемов, разработанных для осуществления ковалентной иммобилизации ферментов, исключительно велико. Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента. Ниже представ­лен ряд примеров, иллюстрирующих некоторые способы химической иммобилизации ферментов.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо-группами. Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным

соединением является бромциановый метод, который был предложен Р.Аксеном,

Дж. Поратом и С.Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов:

Иммобилизация ферментов носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с аро­матическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азо-соединения, в составе которых белок связан с носителями:

Существенно, что п-аминофенильные функции могут быть легко введены в разнообразные носители.

Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соедине­ния аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Например,

Реакционная способность производных карбоновых кислот в реакциях ацилирования аминогрупп фермента уменьшается от галогенангидридов до эфиров.

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрилъными группа-ми. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образова-нием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха:

Дата добавления: 2015-06-28