Методы выделения чистых культур аэробов (механические и биологические). Колония, чистая культура.

Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. Для выделения чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:

ü Механическом разобщении бактериальных клеток

o Метод Дригальского - распределение капли суспензии материала с

ü помощью шпателя;

o Рассев штрихом;

o Метод Коха является количественным и позволяет определить

ü количество бактерий в исследуемом материале

ü Биологические методы:

o Посев на элективные среды;

o Метод Шукевича - посев материала в конденсат скошенного МПА для

ü выделения чистых культур бактерий, обладающих ползучим ростом

ü (например, протей);

o Обработка кислотами и щелочами (например, микобактерии

ü туберкулеза);

o Прогревание при 80°С для выделения споровых форм;

o Заражение лабораторных животных - для диагностики зоонозов и др.

ü (туляремия).

Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются элективные питательные среды.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза. Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонногоагара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43— 45 °С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. После этого прокаленной и остуженной; петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

40. Метод Дригальского, назначение, этапы: I ΙΙ, III, IV.

Метод Дригальского основан на механическом разобщении на поверхности плотной, питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуемого материала.

I этап.

1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовление

мазка* окраска по Граму). v

2. Посев на чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность

МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового

материала, засевают вторую и третью чашки.

3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате

18-20 часов при температуре 37°С.

II этап.

1. Макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске,

характеру поверхности, краев, консистенции..

2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовление

мазка, окраска по Граму).

3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным агаром.

4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37°С.

III этап.

Проверка культуры на чистоту (макроскопическим - однородный рост, микроскопическим — однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признаками клетки).

IV этап.

Идентификация проводится по:

- ферментативным свойствам.

- антигенным свойствам, токсигенности и другим признакам

- фагочувствительности

41. Выделение чистой культуры анаэробов (I, II, III, IV, V этапы).

I этап — обогащение на среде Китт-Тароцци, предварительно прокипяченной

в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для

уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются.

II этап - получение изолированных колоний. На среде Китт-Тароцци

обнаруживается помутнение с пузырьками газа.

Ш этап - выделение чистой культуры проводится по одному из следующих

методов:

А) По Цейсслеру - каплю материала со среды Китт-Тароцци засевают в

чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же

шпателем производят посев во второй и третьей чашках;

Б) По Вейнбергу - каплю материала со среды Китт-Тароцци переносят в

растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки

Веньял-Вейона и инкубируют в термостате.

IV и V этапы - идентификация в реакции нейтрализации на белых мышах.

42. Вирусологические методы. Назначение, принцип.

Вирусологический метод включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Материалами могут быть кровь, другие биологические и патологические жидкости, биоптаты органов и тканей.

Вирусологическое исследование крови часто проводят с целью диагностики арбовирусных инфекций. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа и других ОРВИ, кори. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеро-, адено-, рео- и ротавирусы.

Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности', например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, поэтому для выделения определенного вируса используют соответствующую культуру ткани. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментно заражать 3—4 культуры клеток, предполагая, что одна из них может оказаться чувствительной. Наличие вируса в зараженных культурах определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлюоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации. Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Чаще всего используют эмбрионы кур. При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (арбовирусы), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.

Вирусы идентифицируют с помощью иммунологических методов: реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле, иммунофлюоресценции.

43. Методы культивирования микоплазм, риккетсий, хламидий и вирусов.

Существуют такие методы культивирования вирусов: в клеточных культурах, в куриных эмбрионах, в организме лабораторных животных. Методы культивирования вирусов в клетках наиболее распространенны.

Виды клеточных культур:

а) первичные - готовят из нормальных тканей эмбриональных или взрослых организмов путем трипсинизации, выдерживают 2-4 пассажа.

б) перевиваемые или пассажные - готовят из тканей злокачественных опухо-лей, выдерживают тысячи генераций (HELa);

в) полуперевиваемые - выдерживают до 70 пассажей (диплоидные клетки легких человека).

Для получения однослойной тканевой культуры используются пита-тельные среды: 199, Игла, Хенкса. Выявление репродукции вирусов в культуре ткани:

а) по цитопатическому действию вирусов: полная или частичная деструкция монослоя; изменение формы клеток; возникновение многоядерных клеток и симпластов;

б) образование внутриклеточных включений - место усиленного размноже-ния вирусов и реакция клетки на внедрение вируса;

в) с помощью реакции гемадсорбции;

г) по цветной пробе;

д) выявление вирусного гемаглютинина или вирусного антигена в РГА и РСК; е) выявление вирусных бляшек.

2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах используется огра-ниченно, так как только некоторые вирусы репродуцируются в тканях куриного эмбриона (вирус натуральной оспы, гриппа, герпеса простого, эпидемического паротита). Место введения вирусосодержащего материала:

а) в полость амниона и алантоисную;

б) в желтковый мешок;

в) в мозг, тело эмбриона;

г) на хорионалантоисную оболочку.

Определение репродукции вирусов проводится по специфическим из-менениям в эмбрионе и с помощью РГА (вирус гриппа).

Специфические изменения в эмбрионе:

а) бляшки на хорионалантоисной оболочке (вирусы натуральной оспы и ос-повакцины);

б) диффузное помутнение оболочек;

в) появление кровоизлияний;

г) участки некроза.

3. Культивирование вирусов в организме животных (вирусы Коксаки, бешенства) имеет положительные стороны - доступность, четкость симпто-мов, моделирование инфекционного процесса, накопление вируса в большом количестве (для получения вакцин). Недостатки - не все вирусы можно куль-тивировать, лабораторные животные - открытая система, которая содержит собственную микрофлору, в том числе и латентные вирусы.

Культивирование риккетсий и хламидий проводится теми же методами, что и вирусов. Так, риккетсии можно культивировать в желточном мешке куриного эмбриону, в легких белых мышей и кишечника вшей. Хла-мидии также можно культивировать в желточном мешке куриного эмбриона и при внутримозговом заражении белых мышей.

44. Современные принципы классификации и номенклатура вирусов.

Основные свойства вирусов (и плазмид), по которым они отличаются от остального живого мира.

1.Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие- от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм.

2.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа- или ДНК (ДНК- вирусы) или РНК (РНК- вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК.

3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4.Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты.

5.У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок- синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

6.Средой обитания вирусов являются живые клетки- бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.

Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной- вирион и внутриклеточной- вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов- конечной фазы развития вирусов.

Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают:

а) ДНК-содержащие

б) РНК-содержащие вирусы.

Они обычно гаплоидны, т.е. имеют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.

Среди РНК- содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК).

Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию.

Дата добавления: 2017-02-01